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目的:嗜血杆菌属（Haemophilus）是一类可正常定植于人体上呼吸道的革兰阴性苛养菌,且在一定条件可以引起人的感染,包括肺炎、中耳炎、脑膜炎和感染性心内膜炎等。本课题拟采用传统细菌培养方法,研究嗜血杆菌在人体各个部位的分布特征和主要种类,同时选取痰液标本中的精液嗜血杆菌样新菌种进行多相分类鉴定,并基于全基因组测序数据对精液嗜血杆菌进行重新分类研究。方法:收集2018年8月-2020年8月期间送检于广东省中医院大学城医院的呼吸道、泌尿生殖道、胃肠道和皮肤系统的各种来源标本,进行嗜血杆菌的分离培养、菌种鉴定和分型研究,研究人体各个部位的分布特征和主要种类。收集广州市某区级医院以全自动生化鉴定系统VITEK NH卡鉴定为流感嗜血杆菌感染分离株100株,与全自动MALDI-TOF MS鉴定系统（VITEK MS）进行结果比较,以16S rRNA基因测序鉴定对两个系统鉴定的准确性进行评价。对流感嗜血杆菌感染相关的分离株,采用PCR方法扩增荚膜的Hi bexA编码基因、Hi-a和Hi-b编码基因,进行荚膜基因分型,以及基于产生吲哚、鸟氨酸脱羧酶、脲酶3个表型特征进行生物分型,了解流感嗜血杆菌临床感染的主要型别。选取从痰液标本中分离的4株精液嗜血杆菌表型菌株进行多相分类研究:①菌体形态:采用革兰染色镜检和扫描电子显微镜进行菌体形态观察;②营养需求和生理生化特征分析:包括在不同培养基的生长状况、V因子、X因子和V+X因子生长需求实验（卫星试验）、氧化酶实验、触酶实验、吲哚实验、硝酸盐还原实验、精氨酸双水解实验等,API NH和API ZYM鉴定系统等;③细胞壁化学分类研究:包括细胞脂肪酸分析、多极脂和多胺分析等;④遗传学特征研究:16S rRNA基因测序和系统发育树分析、蛋白质质谱分析、基于全基因组测序的平均核苷酸一致率ANI分析等。利用第二代和第三代分子测序技术,对SZY H68T菌株进行全基组测序,得到菌株的全基因组完成图,以细菌毒力因子数据库（Virulence Factor Database,VFDB）（http://www.mgc.ac.cn/vfs）对基因组数据进行比较基因组学分析和毒力基因分析。结果:共收集了 1503份人体标本,其中包括呼吸道标本1085份,泌尿生殖道204份,皮肤标本62份,胃肠道标本152份。在1503份人体标本中,138份标本培养到嗜血杆菌;其中呼吸道阳性标本123份,阳性率11.3%;泌尿生殖道阳性标本12份,阳性率5.9%;胃肠道标本2份,阳性率1.3%;皮肤标本1份,阳性率1.6%。菌种类型包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、溶血嗜血杆菌以及多个未能分类的新菌种。以16S rRNA基因测序为最终鉴定依据,发现Vitek NH鉴定的100株流感嗜血杆菌,仅68株为真正的流感嗜血杆菌,即鉴定的准确率为68%;而32株误鉴定的菌株中,主要包括:3株溶血嗜血杆菌、4株副流感嗜血杆菌、5株埃及嗜血杆菌、以及20株16S rRNA基因不能鉴定的潜在新种（其16S rRNA基因序列与已知模式菌种相似度＜98.7%）。而VITEK MS质谱系统鉴定结果的准确性为74%,略高于Vitek NH。对本地区68株流感嗜血杆菌的荚膜分型结果显示,5株非a、b荚膜型,占比7.3%;1株为b型,占比1.5%;62株为荚膜分型不可分型流感嗜血杆菌,占比91.2%。筛选到4株精液嗜血杆菌表型菌株（SZY H68T、SZY H8、SZYH35、SZY H36）,其16S rRNA基因序列之间的相似度＞99.45%,且与已知模式菌种相似度＜98.7%,为潜在新种。选取SZY H68T为模式菌株,其多相分类鉴定结果显示:①表型特征:实验菌株SZY-H68T为革兰阴性球杆菌,兼性厌氧,在嗜血巧克力琼脂平板和普通巧克力琼脂平板上生长良好,在血平板上微弱生长,而在麦康凯、MH和BHI琼脂培养基上不生长,具有V因子生长依赖性,48h后在嗜血巧克力平板上呈后呈表面光滑、湿润、扁平状、菌落中间稍有凸起,半透明菌落。②生理生化反应:触酶、氧化酶和脲酶均阳性;CAMP试验阴性;不产生溶血现象。③细胞化学特征:实验菌株脂肪酸主要成分为 C14:0、C16:0、Summed Feature 2（iso-C16:1 and/or C14:0 3-OH）和 Summed Feature 3（C16:1ω7c and/or C16:1）;主要的磷脂成分是磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和含氨基的未鉴定磷脂。④16S rRNA基因序列分析显示,实验菌株SZY H68溶血嗜血杆菌与ATCC 33390T相似度为98.06%,与精液嗜血杆菌SZY H1T菌株的相似度为97.40%,与其他嗜血杆菌属内模式菌株的相似度都小于97%;而基于16S rRNA基因构建的系统发育树,4个实验菌株与溶血嗜血杆菌ATCC 33390T菌株聚类成一小分枝。⑤基于全基因组测序的平均核苷酸一致率分析显示:SZY H68与16S rRNA相似度最高的溶血嗜血杆菌 ATCC 33390T相比,其 ANIb/ANIm 值为 92.41%/94.34%;与 16S rRNA 相似度第二高的精液嗜血杆菌SZY H1T的ANIb/ANIm值为95.38%/96.01%。⑥实验菌株SZY H68T已成功保藏于中国典型培养物保藏中心（China Center for Type Culture Collection,CCTCC）（获得永久性保藏号为CCTCC PB 2020023T）和日本技术评价研究所生物资源中心（NITE Biological Resource Center,NBRC）（获得的永久性保藏号为 NBRC 114734T）。菌株SZY H8、SZY H35、SZY H36、SZY H68T预测到的毒力基因数量与总基因数量的比分别为74/1730、76/1816、75/1754、70/1783,与溶血嗜血杆菌的毒力基因分布更类似,其中与黏附（Adherence）、内毒素（Endotoxin）、免疫逃逸（Immune evasion）、铁转运（Iron uptake）功能相关的毒力因子类型居多。结论:嗜血杆菌属在呼吸道、泌尿生殖道、胃肠道和皮肤标本均有分布,其中以呼吸道标本分布率最高,多样性最丰富。当前常用鉴定系统对嗜血杆菌属的种水平鉴定准确率较低。对4株精液嗜血杆菌表型菌株的多相分类鉴定,4株实验菌株为同一个新的亚种,即“精液嗜血杆菌生痰亚种”。毒力基因预测显示,“精液嗜血杆菌生痰亚种”和“精液嗜血杆菌精液亚种”可能为人体呼吸道和生殖道中毒力较低的条件致病菌,其与溶血嗜血杆菌的毒力基因较接近。