转录代谢联合分析槲皮素对酒精性肝损伤的保护及AICAR功能探究

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目的:通过转录组学和代谢组学联合分析,探究槲皮素拮抗酒精性肝病(Alcoholic liver disease,ALD)的潜在机制;基于组学结果,以嘌呤核苷酸从头合成中间产物5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-1H-咪唑-4-甲酰胺(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside,AICAR)和细胞衰老为中心,揭示槲皮素的保护机制。方法:1、动物实验:70只8-9周龄的成年雌性C57BL/6N小鼠被随机分为4组:对照组(con)、酒精组(ET,酒精供能28%)、酒精加槲皮素组(EQ)、槲皮素对照组(Q,100 mg/kg·bw);所有小鼠均采用Lieber-De Carli液体饲料喂养。参照Gao-Bin模型建立慢加急ALD小鼠模型,ET组和EQ组先按酒精浓度从低到高适应性喂养一周,再用酒精液体饲料慢性喂养12周,在最后一天以5 g/kg·bw酒精灌胃,con组和Q组以等热量麦芽糊精灌胃,灌胃9 h后处死小鼠。采用酶活性试验检测谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)和谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)水平;HE染色和油红O染色分别观察小鼠肝组织结构变化和脂质堆积情况;酶学比色法测定小鼠肝脏甘油三酯(Triglyceride,TG)水平。转录组学分析先采用Agilent 2100 bioanalyzer提取小鼠肝组织RNA,随后通过二代测序技术获得相应的RNA序列信息以确定其种类和名称;代谢组学基于LC-MS/MS技术,通过高通量检测手段获得各代谢分子结构信息以确定代谢物类别和名称;对所有检测到的基因和代谢物进行主成分分析、偏最小二乘法判别分析以及KEGG富集分析以筛选差异基因、差异代谢物及相关的生物学通路;液相色谱测定肝脏AICAR水平;Western Blot检测衰老相关蛋白p53、p21以及p16水平;β半乳糖苷酶(β-galactosidase,SA-β-Gal)染色按酶活性试验原理检测肝脏SA-β-Gal活性。酶学比色法测定小鼠血清尿酸水平。2、细胞实验:用0、10、50、100、150μM的酒精或0、1、10、100、500、1000μM的AICAR分别刺激L02细胞24、48、72、96 h后,检测肝细胞转氨酶的释放水平,并采用SA-β-Gal染色观察细胞衰老情况;在100μM酒精刺激的同时,分别给予1、10、20、50μM的槲皮素干预,检测指标同上;在槲皮素干预的基础上给予AICAR处理,检测肝细胞转氨酶释放水平,及衰老相关指标。结果:1、酒精组小鼠血清AST、ALT以及肝脏TG水平明显升高,分别为对照组的1.8倍、2.5倍和1.8倍(P<0.05);HE染色显示酒精组肝组织结构紊乱、肝索断裂,并出现大量空泡;油红O染色结果发现酒精组小鼠肝脏存在大量脂质堆积。与酒精组相比,槲皮素干预后肝脏ALT、AST和TG水平分别降低了55%、35%和25%(P<0.05);肝细胞中空泡数明显减少,脂滴变小且数量减少。2、(1)转录组学筛选到酒精和槲皮素共同调节的差异基因共844个,主要涉及类固醇代谢、脂质生物合成、氨基酸及其衍生物代谢过程以及核苷酸磷酸化等通路。(2)代谢组学筛选到37种被酒精和槲皮素共同调节的差异代谢物,主要与嘧啶代谢、嘌呤代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢以及一些氨基酸代谢通路有关。(3)转录组学与代谢组学联合分析的结果表明,酒精和槲皮素共同调节半乳糖代谢、胆固醇代谢、AMPK信号通路以及嘌呤代谢等通路,其中嘌呤代谢通路富集到的差异基因数和差异代谢物数量最多。与对照组相比,酒精摄入引起嘌呤核苷酸从头合成的基因,如GART三功能酶(磷酸核糖甘氨酰胺合成酶/磷酸核糖甘氨酰胺甲酰基转移酶/磷酸核糖氨基咪唑合成酶)、PAICS双功能酶(磷酸核糖氨基咪唑羧化酶/磷酸核糖氨基咪唑琥珀酰甲酰胺合成酶)等表达显著上调,嘌呤核苷酸从头合成产物水平升高,其中AICAR水平升高约10倍(P<0.05);相比于酒精组,槲皮素干预明显下调嘌呤核苷酸从头合成的基因GART三功能酶和PAICS双功能酶的表达,并且使嘌呤核苷酸从头合成的产物AICAR水平降低约5倍(P<0.05);此外,与对照组相比,酒精摄入还导致嘌呤核苷酸分解代谢的基因5’-核苷酸酶和嘌呤核苷酸磷酸化酶表达上调,分解代谢产物鸟嘌呤、鸟嘌呤核苷升高;相比于酒精组,槲皮素喂养下调5’-核苷酸酶的表达。3、液相色谱检测发现,酒精摄入导致肝脏AICAR水平升高,约为对照组的1.6倍(P<0.05);相比于酒精组,槲皮素干预后AICAR水平约降低48%(P<0.05)。小鼠血清尿酸水平在各组间均无明显差异。4、筛选酒精组和酒精加槲皮素组转录组学结果中与细胞周期阻滞相关的通路发现,细胞衰老通路富集到的差异基因最多。并且与对照组相比,酒精组小鼠肝脏衰老相关蛋白p53、p21和p16显著升高(P<0.05),SA-β-Gal活性升高;槲皮素干预后,小鼠肝脏p53、p21和p16蛋白水平相比于酒精组分别降低了55%,55%和35%(P<0.05)。5、100μM酒精或500μM AICAR刺激L02细胞72 h导致肝细胞ALT、AST释放水平显著升高(P<0.05),并诱导肝细胞衰老,表现为SA-β-Gal活性升高。与酒精处理组相比,20μM槲皮素干预72 h明显减少肝细胞ALT、AST的释放(P<0.05),同时降低衰老相关蛋白p53、p21和p16蛋白水平,分别降低31%、39%和33%(P<0.05),且SA-β-Gal活性降低,细胞增殖减少。相比于槲皮素干预组,AICAR处理导致肝细胞ALT、AST释放增加,肝细胞衰老增加,其中p53、p21和p16蛋白水平分别升高2.4倍、1.7倍和1.4倍(P<0.05),且肝细胞增殖减少。结论:酒精摄入导致小鼠肝脏损伤、肝脂肪变性以及肝脏衰老的发生,槲皮素干预明显缓解上述表现,可能与槲皮素调节嘌呤核苷酸代谢,降低嘌呤核苷酸从头合成中间产物AICAR水平有关。
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