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干燥综合征(SS)是一种以淋巴细胞等细胞侵犯泪腺、唾液腺等外分泌腺为主的,以自身抗体为介导的慢性全身性自身免疫性疾病,在我国的患病率为0.77%。目前该疾病的详细发病机制尚未明确阐述,认为该疾病的发生是由多因素引发的,包括遗传、病毒感染、自身免疫等,其中自身抗原在干燥综合征的发生中具有重要作用。近十年来许多研究包括我们的工作陆续发现抗毒蕈碱受体3(M3R)抗体是干燥综合征特异性抗体之一,在临床诊断上具有较高的敏感度和特异性。在自身免疫病患者机体免疫应答过程中,自身抗原被降解为多肽与主要组织相容性复合物(MHC)结合,进而引起相关免疫学反应,因此研究自身抗原表位多肽在SS发生中的作用具有直接的重要意义。基于以上原因,首先利用计算机模拟以及Westernblot、ELISA等免疫学方法从三条M3R抗原表位多肽(N49,N251和N412)中筛选得到一条抗原表位多肽(N49),进一步通过检测干燥综合征动物模型中抗N49多肽抗体和免疫N49多肽来更全面的了解M3R及其抗原表位在干燥综合征发生中的作用。从以下三个方面进行了相关研究。
1.毒蕈碱受体3抗原表位筛选及其在原发性干燥综合征诊断中的作用运用计算机软件分析毒蕈碱受体3(M3R)蛋白的结构特点及抗原决定簇分布,根据结果设计合成3条多肽。比较合成多肽与抗M3受体抗体阳性干燥综合征(SS)患者血清IgG的反应强弱,获得一条抗原抗体反应最强的抗原表位多肽(N49)。进一步以多肽N49作为包被抗原,检测原发性SS(pSS)患者41例,继发SS(sSS)患者25例,系统性红斑狼疮(SLE)患者34例,类风湿性关节炎(RA)患者80例和正常人174份血清中抗M3多肽IgG抗体,结果显示该多肽抗体在原发性SS患者血清中的阳性率为53.7%,明显高于sSS患者28%、SLE患者8.8%、RA患者25%和正常人12.1%。抗N49多肽抗体在原发性SS诊断中的敏感性为53.7%,特异性为83.7%,而且该抗体的检测对于抗SSA抗体、抗SSB抗体或抗α-胞衬蛋白(α-fodrin)抗体阴性的原发性SS患者的诊断具有补充作用。表明,筛选获得的M3抗原表位多肽N49,其检测抗体在原发性SS临床血清诊断中具有很好的应用价值。
2.抗毒蕈碱受体3抗原表位多肽抗体在干燥综合征动物模型发生中的意义颌下腺组织匀浆诱导型干燥综合征动物模型是最常用的干燥综合征动物模型之一,为探讨抗毒蕈碱受体3(M3R)抗原表位多肽抗体在干燥综合征(SS)小鼠模型发生中的意义,利用颌下腺组织匀浆与百日咳疫苗诱导小鼠SS动物模型,以生理盐水免疫小鼠作为对照组,检测各组小鼠血清中抗M3R3条抗原表位多肽(N49、N251和N412)抗体,抗α-fodrin抗体和抗SSA/SSB抗体滴度及颌下腺淋巴细胞浸润情况。结果显示颌下腺组织匀浆免疫组小鼠血清中存在抗M3R多肽抗体,抗M3R表位多肽N49、N251、N412抗体,抗α-fodrin抗体和抗SSA抗体阳性率分别为90%(18/20)、95%(19/20)、95%(19/20)、90%(18/20)和50%(10/20),但是为检测到抗SSB抗体。M3R的三条多肽中N49多肽与血清反应OD值最大;有7只(7/20)小鼠颌下腺出现淋巴细胞浸润现象。对照组小鼠血清抗M3R3条多肽抗体均为阴性,抗α-fodrin抗体和抗SSA阳性率皆为10%(2/20),而且有2只(2/20)出现轻度颌下腺淋巴细胞浸润。表明抗M3多肽抗体存在于该小鼠SS模型中,是干燥综合征发生因素之一。为了进一步了解N49表位在干燥综合征发生中的作用,将通过免疫该多肽的方式进行下一步的研究。
3.毒蕈碱受体3抗原表位多肽(N49)诱导干燥综合征动物模型的研究利用毒蕈碱受体3(M3R)抗原表位多肽N49免疫BALB/c小鼠,以生理盐水注射小鼠作为对照组,检测各组小鼠血清抗N49多肽抗体和颌下腺淋巴细胞浸润情况。结果显示多肽免疫组小鼠血清抗N49多肽抗体阳性率达100%(20/20),其中有7只(7/20)小鼠出现颌下腺淋巴细胞浸润;对照组小鼠血清抗N49多肽抗体均为阴性,仅有2只(2/20)出现颌下腺淋巴细胞浸润。进一步以M3R不同抗原表位多肽N251和N412以及另三种自身抗原α-胞衬蛋白(α-fodrin)、SSA和SSB为包被抗原,检测以上实验小鼠血清中的抗体情况,显示第70天时N49多肽免疫组小鼠血清中抗N251和N412多肽抗体以及抗α-fodrin抗体和抗SSA/SSB抗体阳性率分别为100%(20/20)、85%(17/20)、90%(18/20),35%(7/20)和20%(4/20),而对照组小鼠血清中抗N251、N412多肽抗体和抗SSB抗体均为阴性,抗α-fodrin抗体和抗SSA阳性率皆为10%(2/20),试验中未发现抗SSB抗体。最后检测细胞因子发现N49免疫组小鼠血清中IL-10和IFN-γ量明显增加,证实Th1/Th2细胞皆参与了该免疫过程。表明,N49多肽较成功地建立了BALB/c小鼠的干燥综合征(SS)模型,诱导出了典型的自身抗体、颌下腺淋巴细胞浸润和自身抗原M3R分子内、分子间表位扩展等特征,为进一步研究M3R等自身抗原在SS发生中的作用机制奠定了基础。