【摘 要】
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目的:自噬是真核细胞内一种高度保守的分子降解过程,在清除自身异常蛋白和受损细胞器的过程中发挥着关键作用。神经元自噬功能障碍导致衰老蛋白和错误折叠蛋白大量堆积是神经退行性疾病的主要病理特征之一。虽然神经退行性疾病中神经元自噬信号被激活,但是由于自噬流的阻滞,错误折叠蛋白和衰老蛋白不能被正常清除。目前神经退行性疾病神经元自噬流阻滞的具体机制尚不清楚。丝氨酸/苏氨酸激酶Polo kinase 3（PLK
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目的:自噬是真核细胞内一种高度保守的分子降解过程,在清除自身异常蛋白和受损细胞器的过程中发挥着关键作用。神经元自噬功能障碍导致衰老蛋白和错误折叠蛋白大量堆积是神经退行性疾病的主要病理特征之一。虽然神经退行性疾病中神经元自噬信号被激活,但是由于自噬流的阻滞,错误折叠蛋白和衰老蛋白不能被正常清除。目前神经退行性疾病神经元自噬流阻滞的具体机制尚不清楚。丝氨酸/苏氨酸激酶Polo kinase 3（PLK3）作为快速应激蛋白,促进神经元的损伤过程,但是否通过自噬流阻滞影响神经元损伤目前尚不清楚。本课题旨在探究PLK3对神经元细胞自噬水平的影响及其分子机制,为神经退行性疾病的治疗提供新的思路。方法:（1）利用 pcDNA3.1-Myc-PLK3 质粒转染 SH-SY5Y、Neuro-2a（N2A）、HT22和HEK293T细胞,构建PLK3过表达的细胞模型。（2）使用衣霉素（Tunicamycine,TM）诱导内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）,利用 Western blotting 检测 PLK3、重链结合蛋白（Heavy chain-binding protein,BIP）、C/EBP 同源蛋白（C/EBP-homologous protein,CHOP）、微管相关轻链蛋白（Microtubule-associated protein 1 Light Chain3,LC3）、选择性自噬接头蛋白（Sequestosome 1,SQSTM1/p62）以及聚 ADP 核糖聚合酶（Poly ADP-ribose Polymerase,PARP）的蛋白水平。（3）利用 siRNA 敲低PLK3的表达,Western blotting 检测 BIP、CHOP、LC3-Ⅱ、p62 和 cleaved-PARP 的蛋白水平。利用 siRNA 敲低 PFN1 的表达,Western blotting检测LC3-Ⅱ和p62的蛋白水平。（4）利用激光共聚焦显微镜观察LC3点状聚集情况、自噬体与溶酶体的融合情况以及细胞骨架的形态变化。（5）利用定点突变技术构建PLK3激酶激活型（T219D）和激酶失活型（K91R）质粒。（6）通过蛋白质组学、免疫共沉淀以及细胞免疫荧光等技术筛选并验证PLK3相互作用蛋白。（7）利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;利用MTT实验检测细胞活力。（8）利用Western blotting检测APP/PS1转基因小鼠和MPTP模型小鼠中PLK3的蛋白表达情况。结果:（1）Western blotting实验结果发现,TM刺激的SH-SY5Y细胞中PLK3表达上调;敲低PLK3可明显抑制TM刺激引起的LC3-Ⅱ和p62的蛋白水平增加。PLK3过表达可引起神经元细胞内LC3-Ⅱ和p62的蛋白水平增加。（2）细胞免疫荧光实验结果发现,PLK3过表达可阻断自噬体与溶酶体融合引起自噬流阻滞;（3）Western blotting实验结果发现,PLKs抑制剂BI2536可以抑制PLK3过表达引起的LC3-Ⅱ和p62的堆积;过表达PLK3激酶失活型（K91R）不能引起LC3-Ⅱ和p62堆积。（4）蛋白质组学、免疫共沉淀以及细胞免疫荧光实验结果发现,PLK3与肌动蛋白结合蛋白（Profilin-1,PFN1）有相互结合作用。PLK3过表达可导致细胞骨架损伤;过表达PFN1能缓解PLK3过表达引起的LC3-Ⅱ和p62的堆积。（5）流式细胞实验、MTT以及Western blotting实验结果发现,PLK3过表达能引起神经元损伤,白藜芦醇能逆转PLK3过表达引起的神经元损伤。（6）Western blotting实验结果发现,PLK3在阿尔兹海默症模型APP/PS1转基因小鼠脑中表达上调。结论:（1）内质网应激诱导PLK3表达上调及自噬体堆积。（2）PLK3过表达可引起自噬体堆积、自噬底物降解受阻以及自噬流阻滞。（3）PLK3过表达抑制自噬体与溶酶体的融合。（4）PLK3可通过与PFN1结合抑制PFN1调控的肌动蛋白的聚集,进而影响自噬体与溶酶体的融合。（5）PLK3过表达可引起的神经元损伤,白藜芦醇能缓解PLK3过表达引起的神经元损伤。（6）PLK3在APP/PS1转基因AD模型小鼠脑中表达上调。
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