[研究目的]该研究的试验对象是经体外进行培养的人肾小管上皮细胞(humankidney-2 cells,HK-2 cel)。首先,探讨hUC-MSC是否能增加被AOPPs抑制的HK-2细胞中的自噬活性,并明确hUC-MSC增加HK-2细胞中的自噬活性的通路机制;其次,阐明miR-145是否能增加HK-2细胞中的自噬活性及其信号通路;最后,阐明hUC-MSC是否通过分泌miR-145介导自噬活性的增加,进而减轻AOPPs对肾小管上皮细胞的损伤作用。[研究方法]1.体外制备无内毒素AOPPs修饰蛋白及鉴定将200mmol/L次氯酸(HOCL)与牛血清白蛋白(BSA)溶液混合,其摩尔比为1:140,在室温下静置30min后,便可制成AOPPs-BSA以备用。其后,把配置好的样品在4摄氏度无菌的PBS中透析24小时,除去游离次氯酸。同时,把未经修饰的BSA溶于PBA中作为对照。没有经过修饰的BSA及全部配置好的AOPPs-BSA采用鲎试验法检测内毒素水平,其含量要低于0.025EU/ml。通过在酸性环境下测定340nm处的吸光度值,在碘化钾存在条件下以氯胺T含量表示AOPPs的浓度。2.人肾小管上皮细胞的培养3.hUC-MSC分离与HK-2细胞的共培养采用组织贴壁法分离hUC-MSC。取足月产健康的新生儿脐带10cm,在超净台内取出脐带,用PBS(含1%双抗)冲洗3次。然后,将脐带剪成小段,取出脐静脉和脐动脉后,余下的胶冻状组织,即华通氏胶。华通氏胶被切成1mm×1mm×1mm大小在DMEM/F12培养基培养(包含5%胎牛血清),选择3-6代进行实验。我们采用共培养transwell小室阻断hUC-MSC和HK-2细胞的直接接触,探讨hUC-MSC在共培养体系中的旁分泌作用。4.流式细胞技术与hUC-MSC鉴定hUC-MSC采用胰蛋白酶消化,用PBS中将细胞浓度调整为1×106/ml。然后,取200μl混悬液,加入5μl抗体(分别包括CD90,CD105,CD73,CD34,CD45,CDllb,CD14以及HLA-D),在避光的情况下孵育30分钟。一抗直接与FITC和phycoerythrin结合,同时采用非特异性FITC标记的IgG作为对照。最后,用流式细胞术对样本进行分析。5.RNA提取和实时PCR定量分析:利用TRIzol试剂(TaKaRa,日本)从处理过的HK-2细胞中提取RNA。根据试剂的说明书,使用MMLV逆转录酶试剂盒逆转录1μgRNA。U6和miR-145引物由RiboBio公司直接提供(公司提出需要保密序列)。使用内参U6对所用数据进行标准化。6.蛋白免疫印记分析:采用RIPA缓冲液裂解细胞来提取总蛋白。随后,选用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离20-50μg蛋白,然后转移到PVDF膜上,再把PVDF膜浸泡在5%的脱脂奶粉或者BSA中,室温下封闭2小时。加入抗体anti-LC3B、anti-Beclin1、anti-p62、anti-p-mTOR、anti-mTOR、anti-p-AKT、anti-AKT、anti-p-PI3K(稀释,1:1000)和anti-GAPDH(稀释,1:50 000),在4℃孵育过夜。次日用稀释好的辣根过氧化酶(HRP)标记好的二抗与上述PVDF膜在室温下孵育1小时,用增强化学系统(ECL)检测蛋白。以GAPDH为内参,采用ImageJ系统进行半定量分析。7.细胞免疫荧光染色:收集96孔板的细胞,用4%多聚甲醛固定10分钟,然后用0.5%Triton X-100透膜10分钟,并在含5%BSA的缓冲液中在室温下孵育30分钟。然后,细胞与LC3B抗体(1:50稀释)在4℃下孵育过夜。最后,用荧光标记的二抗(Alexa Fluor 488,1:40 00,Gongsi)在避光中室温下孵育细胞1 h,再用0.1%的DAPI孵育10 min。最后用倒置荧光显微镜观察并记录LC3B阳性染色。8.透射电子显微镜:用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)对HK-2细胞进行慢速离心,离心速度为1000 r/m,离心时间为5 min。然后,用冷PBS洗涤沉淀物两次,并投入2.5%戊二醛中4℃下固定2小时。然后用二甲砷酸钠缓冲液洗三次,再放入相同缓冲液配制的1%锇酸内固定2小时(4℃)。细胞常规脱水、浸透、包埋、聚合、超薄切片(60nm)、染色。水洗后同以上方法再置入柠檬酸铅染液中染色15分钟,水洗两次,干燥后观察。电镜下观察,在低倍镜(×6000,×8000,×10000)或高倍镜(×40000)下,用透射电镜观察自噬体(AP)和自噬溶酶体(AL)的形成,数码拍照。9.HK-2细胞和hUC-MSC的转染:按照试剂盒说明操作,用miR-145siRNA、miR-145mimics或阴性siRNA转染HK-2细胞,同时使用Lipofectamine2000(Invitrogen公司,美国)转染miR-145 siRNA到hUC-MSCs。靶向序列如下:miR-145 siRNA:sense(5’-AGGGAUUCCUGGGAAAACUGGAC-3’);miR-145 mimics:sense(5’-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3’),antisense(5’-GGAUUCCUGGGAAAACUGGACUU-3’);negative siRNA:sense(5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’),antisense(5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’).10.统计学分析:采用SPSS 20.0软件进行统计分析。连续变量以均值±标准差表示。采用单因素方差分析以确定组间差异。方差齐时两两比较采用LSD,方差不齐时采用Dunnett T3。P<0.05认为差异有统计学意义。[结果]1.hUC-MSC的鉴定结果选择第三代hUC-MSC,采用流式细胞术鉴定细胞表型。流式细胞术结果提示,hUC-MSC表达CD90、CD105和CD73,几乎不表达CD34、CD45、CDllb、CD14和HLA-D。2.hUC-MSC共同培养系统下的HK-2细胞的miR-145上调当HK-2细胞与hUC-MSC共培养时,miR-145的mRNA水平显著上调。敲除hUC-MSC中的miR-145后再将其与HK-2细胞共培养,发现HK-2细胞中的miR-145并没有增加。这些数据表明hUC-MSC分泌miR-145并通过旁分泌作用将其转移至HK-2细胞。3.miR-145对HK-2细胞自噬影响我们下调或上调HK-2细胞中miR-145的表达,并检测miR-145的mRNA水平。RT-qPCR结果显示miR-145 siRNA下调了miR-145的表达,而miR-145 mimics上调了HK-2细胞中miR-145的表达。同时,siRNA阴性组与正常对照组比较,miR-145的表达无差异。然后,通过蛋白免疫印迹测定自噬相关蛋白LC3B,Beclin1和p62的蛋白水平。结果显示,当miR 145 siRNA抑制miR-145的表达时,LC3Ⅱ和Beclin 1蛋白水平下降,p62蛋白水平升高。然而,当上调miR-145的表达时,上述标记的蛋白质水平的表达变化则相反。此外,阴性siRNA组与正常对照组比较无显著性差异。同时,采用细胞免疫荧光技术和透射电镜(TEM)检测HK-2细胞的自噬活性。在转染miR-145siRNA的HK-2细胞中,LC3B阳性染色荧光明显降低,而与正常对照组相比,转染miR-145mimics的HK-2细胞中LC3B阳性染色荧光明显增强。同理,TEM结果显示miR-145siRNA转染细胞中典型自噬体的数量减少,但与正常对照组相比,miR-145 mimics转染的HK-2细胞的APS和ALS数量增加。总之,这些结果表明miR-145的过度表达能激活HK-2细胞的自噬。4.miR-145介导hUC-MSC增加HK-2细胞的自噬活性为了进一步证实hUC-MSC增强的自噬是由其分泌的miR-145介导的,我们将AOPPs处理的HK-2细胞与hUC-MSC共培养后紧接着转染miR-145 siRNA。首先检测miR-145在转染和共培养系统中的表达,RT-qPCR分析显示,hUC-MSC和AOPPs共培养组中miR-145水平高于正常对照组,但转染和共培养系统中miR-145水平较hUC-MSC和AOPPs共培养组降低。接下来,在hUC-MSC和AOPPs共培养系统中转染miR-145 siRNA后检测HK-2细胞的自噬活性。蛋白免疫印迹结果显示,与hUC-MSC共培养系统相比,当miR-145 siRNA降低miR-145的表达时,LC3II和Beclin 1蛋白水平下降,p62蛋白水平升高。此外,转染miR-145 siRNA的细胞与hUC-MSC共培养系统相比,LC3B阳性染色荧光明显减弱。同样,TEM结果显示,与单独hUC-MSC共培养系统相比,在miR-145 siRNA转染与hUC-MSC共培养系统中HK-2细胞中典型自噬体数量减少。总之,这些结果表明hUC-MSC通过分泌miR-145增加HK-2细胞的自噬。5.miR-145通过抑制PI3K/AKIT/mTOR信号通路,介导hUC-MSC增强HK-2细胞的自噬蛋白免疫印迹结果表明,当通过miR-145 siRNA降低miR-145的表达时,可诱导PI3K、AKT和mTOR的磷酸化。然而,当miR-145mimics上调miR-145的表达时,PI3K、AKT和mTOR的磷酸化受到抑制。最后,在hUC-MSC共培养体系中转染miR-145siRNA后,被hUC-MSC抑制的PI3K、AKT和mTOR的磷酸化又重新被激活。由此我们得出结论,miR-145通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,介导hUC-MSC增强HK-2细胞的自噬。[结论]hUC-MSC旁分泌的miR-145通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,介导hUC-MSCs增强HK-2细胞的自噬活性。