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研究背景与目的神经退行性疾病是现代社会公共医疗卫生面临的巨大挑战,这类疾病的发生和发展主要与神经元的损伤和丢失有关。神经元不可再生的特性导致了这类疾病的不可逆转性。目前,临床上对神经退行性疾病的治疗主要是依靠药物控制,从而缓解疾病的发展进程。但是,药物对神经退行性疾病的作用效果并不显著。因此,未来开展新的治疗方法是十分必要的。神经细胞移植,作为一种将体外培养的神经细胞移植至宿主体内的技术,未来可能成为治疗神经退行性疾病的一种重要方法。近年来,通过不同方法将体细胞重编程为诱导神经元（induced neurons,iNs）受到国内外研究者的广泛关注,这也可能成为神经退行性疾病细胞替代治疗的重要方案之一。传统神经元的获得方法主要是体内分离神经干细胞（neural stem cell,NSCs）或胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）,将干细胞进行体外培养诱导分化为神经元。但是,神经干细胞的增殖能力在一定程度上具有其自身的局限性,且不易获得。因此,体细胞重编程技术的出现和发展为神经退行性疾病细胞替代治疗研究带来了新的契机。早在2006年,日本学者Takahashi和Yamanaka通过四种转录因子（Oct3/4,Sox2,c-Myc,Klf4）将体细胞重编程为诱导性多能干细胞（induced plurpotent stem cells,i PSCs）。i PSCs是一种全能状态的细胞,可以诱导成为神经元或胶质细胞,并用于神经退行性疾病的治疗。但是,i PSCs在诱导分化的过程中存在周期长、操作繁琐、潜在的致瘤性等不利因素。而外源转录因子的应用在重编程体细胞为i PSCs的过程中也存在潜在的隐患。因此,寻求一种更简便安全、易于操控的方法成为了科学家研究的热点。最近有研究发现,小分子化合物（small molecular compounds,SMs）可以将体细胞高效地重编程为iNs,被认为是神经退行性疾病细胞治疗的重要突破点。基于以上研究背景,本实验拟采用SMs（VCFYRP）包括VPA、CHIR99021、Forskolin、Y-27632、Repsox、P7C3-A20,开展其体内、体外诱导大鼠成纤维细胞高效重编程为神经元的研究。在体外,通过VCFYRP诱导大鼠胚胎成纤维细胞（rat embryonic fibroblasts,REFs）重编程为iNs,并检测重编程过程中iNs的生物学特性。此外,通过水凝胶负载缓释VCFYRP进行在体重编程研究。该研究将为神经退行性疾病的细胞替代治疗提供了新的研究思路和方法。材料和方法1.REFs通过组织块贴壁法进行原代培养和鉴定,采用免疫荧光检测成纤维细胞的标志蛋白波形蛋白（Vemintin）,纤维连接蛋白（Fibronectin,Fn）,神经元的标志蛋白神经元III类β-微管蛋白（neuronal class IIIβ-tubulin,TUJ1）和神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）,并将第三代REFs用于重编程实验。2.SMs组合（VCFYRP）将REFs重编程为iNs,并通过免疫荧光和Western blot检测REFs重编程为iNs过程中神经元相关蛋白TUJ1、NSE和酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）。3.RT-q PCR检测iNs的神经元的标记基因TUJ1、NSE、TH、γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid,GABA）、胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase,Chat）和Nur相关因子1（Nur correlation factor 1,Nurr1）,以及成纤维细胞相关基因Fn,结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）和Ⅰ型胶原α1（Type Collagenα1Ⅰ,COL1A1）的表达。4.通过Cell Counting Kit-8检测iNs的增殖能力。5.通过流式细胞术检测iNs的细胞周期、凋亡水平和蛋白质合成水平。6.通过水凝胶负载SMs（VCFYRP）进行在体重编程,在术后7天取皮肤组织进行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色和免疫荧光分析TUJ1、NSE的表达情况。结果1.REFs的鉴定:免疫荧光结果表明,REFs表达成纤维细胞的标志蛋白Vemintin和Fn,阳性率高达97%以上,且不表达神经元的标志蛋白TUJ1和NSE。2.免疫荧光和Western blot检测iNs相关蛋白表达升高:2.1 REFs经SMs（VCFYRP）重编程后转化为iNs,iNs在形态上与神经元相似,出现了双极和多极的形态特征。2.2免疫荧光和Western blot检测结果表明神经元的标志蛋白TUJ1、NSE和TH的表达随着诱导时间延长逐渐增加,与REFs相比,具有显著性差异（P＜0.05,n=3）。3.RT-q PCR检测iNs相关基因表达升高3.1 RT-q PCR检测结果表明,在REFs重编程过程中,神经元相关基因TUJ1、NSE、GABA、TH、Chat和Nurr1表达上调,实验组和对照组相比较具有显著性差异（P＜0.05,n=3）;3.2成纤维相关基因Fn,CTGF和COL1A1表达降低（P＜0.05,n=3）;4.重编程过程中iNs的增殖和凋亡能力的改变:4.1 iNs在重编程1天后S期的细胞数量显著下降,与对照组相比,具有显著性差异（P＜0.05,n=3）;4.2 CCK8检测结果表明,iNs的增殖能力在重编程24 h后显著下降,与0 h组相比,具有显著性差异（P＜0.05,n=3）;4.3流式细胞术和Western blot结果表明重编程过程中,细胞凋亡率呈现先上升后降低的趋势,实验组和对照组相比较具有显著性差异（P＜0.05,n=3）;4.4流式细胞术结果表明重编程iNs几乎不表达NSCs的标志蛋白Nestin。5.流式细胞术检测iNs蛋白质合成水平的变化:蛋白质合成实验结果表明iNs重编程早期的蛋白质合成水平显著高于对照组,5天后逐渐下降,最后保持在一个平稳的状态（P＜0.05,n=3）。6.水凝胶负载SMs进行在体化学重编程:SMs负载水凝胶进行在体重编程,免疫荧光结果表明神经元的标志蛋白TUJ1和NSE术后7天在组织中表达。结论1.SMs（VCFYRP）在体外可将REFs重编程为iNs,且细胞的增殖、凋亡和蛋白质合成水平在重编程过程中发生改变;2.水凝胶负载缓释SMs可以用于在体重编程iNs。