背景:心肌梗死（myocardial infarction,MI）主要由心肌组织急性、持续性缺血或缺氧引起,是世界范围内死亡和致残的主要原因。病理上,心肌梗死可导致氧化应激、能量代谢改变、凋亡、炎症因子释放和心肌细胞死亡等多种病理变化,进而触发促纤维化和肥厚性信号级联,发展为心室重构,甚至心力衰竭。超分子多肽水凝胶是通过肽基分子非共价键相互作用组装而成,可局部注射。因此,超分子多肽水凝胶常被用于包载药物或生长因子以治疗相关疾病。瞬时受体电位香草酸蛋白亚型1（transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1）是一种非选择性的阳离子门控通道,可被辣椒素、热刺激、酸性环境或内源性介质等一系列物理或化学伤害性刺激所激活。既往研究表明,TRPV1的过度激活在心肌缺血后的病理改变中起重要作用。Gross等人从TRPV1的TRP结构域C端提取了一个11个氨基酸的多肽（R701-S711）,并将其与TAT47-57结合生成V1-Cal（YGRKKRRQRRRGSGRAITILDTEKS）,用于细胞内转运。他们发现V1-Cal可以有效地减小心肌梗死面积。在离体和在体心肌缺血再灌注（myocardial ischemia-reperfusion,MIR）模型中,V1-Cal分别降低了61.2%和60.7%的心肌损伤程度。由于常规给药V1-Cal的半衰期较短,最新研究报道,在糖尿病鼠模型中,通过持续泵入V1-Cal,可以减少血管内皮细胞的损伤,促进动脉损伤后血管生成。然而,利用生物材料作为载体持续释放V1-Cal治疗心肌梗死尚未见报道。基于以上文献研究,我们提出假设,是否可以将V1-Cal与超分子水凝胶共组装成持续释放V1-Cal的水凝胶,以减少心室重构,改善心功能,最终治疗心肌梗死?为实现这一目标,我们筛选出了Nap-Phe-Phe-Tyr（NapFFY）成胶因子,并用以与V1-Cal共组装,获得了一种新的超分子水凝胶V1-Cal/NapFFY。结果表明,将V1-Cal/NapFFY水凝胶注射到MI区后,V1-Cal缓慢释放,有效地降低了MI大鼠心肌TRPV1的表达和激活,减少了心肌细胞凋亡和炎症因子的释放。第一部分超分子水凝胶V1-Cal/NapFFY合成的可行性、可靠性、安全性研究材料和方法1.合成成胶因子采用固相多肽合成法（solid phase peptide synthesis,SPPS）合成了Phe-Phe-Tyr-OH（FFY）、Phe-Phe-Phe-Tyr-OH（FFFY）、Nap-Phe-Phe-Tyr-OH（NapFFY）、Fmoc-Phe-Phe-Tyr-OH（FmocFFY）化合物,并采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatograph,HPLC）对其进行了纯化。2.临界聚集浓度（Critical aggregation concentrations,CACs）测定在不同浓度梯度的水凝胶器上配置PBS,充分搅拌后调节p H至8.0。然后,利用荧光测量方法,分别采用254 nm的苯环激发波和268 nm的Nap激发波分析发射波长的强度,并利用Origin软件计算临界聚集浓度。3.最小成胶浓度（Minimum gelation concentrations,MGCs）测定用倒置试管实验计算MGC。将加入或不加入药物的不同浓度的水凝胶剂排列在不同的小试剂瓶中,根据前期探索的条件进行凝胶化实验。将水凝胶溶解于PBS中,调节p H至8.0,加热至55℃,冷却至室温。将小试剂瓶倒置,观察试剂瓶内的物质是否会向下流动,即是否会凝胶化。4.125I-V1-Cal的合成在封闭瓶中注射100μL V1-Cal,加入125I-Na I。加入Chloramine-T溶液,启动碘化反应。然后在室温下摇晃。用FCY型X线断层扫描仪和CRC-25R剂量校准仪测量水凝胶中碘125的总放射性。结果1.成胶因子筛选我们设计并通过固相合成的方法合成了四种拟用于载V1-Cal的成胶因子:NapFFY、FFY、FFFY和FmocFFY。根据计算其CAC、MGC以及流变力学,分析其自组装及与V1-Cal共组装性能,筛选最佳成胶因子。研究发现,NapFFY成胶因子具有最佳的成胶性能和与V1-Cal共组装的能力。2.水凝胶NapFFY、V1-Cal/NapFFY、V1-Scr/NapFFY的制备通过对NapFFY的合成和表征,我们根据之前的方法探索了（或w/o）V1-Cal的水凝胶条件。为了得到水凝胶NapFFY,我们先将10 mg NapFFY粉末溶解于1 m L磷酸盐缓冲盐水（PBS,0.01 M,p H 7.4）中,温度为25℃,调整溶液p H值为8.0,然后加热至55℃,直至澄清。溶液冷却至室温（25℃）30 min后形成1.0 wt%的透明水凝胶。Gel V1-Cal/NapFFY水凝胶是将10 mg NapFFY成胶因子和1 mg V1-Cal溶于1 m L PBS（0.01 M,p H 7.4）中,25℃,用同样的方法得到水凝胶。为了证明V1-Cal在MI治疗中的重要作用,我们在此将V1-Cal的肽序列进行了重组,制备了另一种水凝胶Gel V1-Scr/NapFFY。3.NapFFY、V1-Scr/NapFFY和V1-Cal/NapFFY的CAC和MGC为了进一步确定NapFFY、V1-Cal/NapFFY和V1-Scr/NapFFY的凝胶化能力,我们研究了它们的临界聚集浓度（CAC）和最小凝胶化浓度（MGC）。通过荧光发射强度随浓度的变化曲线分析其CAC的临界值,NapFFY的CAC为16.6μM,V1-Cal/NapFFY为16.0μM,V1-Scr/NapFFY为16.4μM。根据它们的CAC值,我们计算出V1-Cal与NapFFY以及V1-Scr与NapFFY的共组装效率为90.8%。倒置试管实验结果表明,Gel NapFFY、Gel V1-Cal/NapFFY和Gel V1-Scr/NapFFY的MGC值均为0.25±0.05 m M,这三种水凝胶的CAC和MGC值相似,说明它们具有相似的自组装能力。4.NapFFY、V1-Scr/NapFFY和V1-Cal/NapFFY流变力学,圆二色谱和TEM表征使用流变力学评估水凝胶（Gel NapFFY,Gel V1-Scr/NapFFY和Gel V1-Cal/NapFFY）的粘弹性特性。首先研究了三种水凝胶的动态应变扫描。三种水凝胶的储能模量（G’）和损耗模量（G”）值在1.0 wt%时均表现出较弱的依赖关系,在0.01%～1%之间G’大于G”,表明所研究的样品均为水凝胶。我们将应变振幅设置为0.1%,对这三种水凝胶进行动态频率扫描。应变幅值为1.0%时,三种水凝胶的G’和G”值均随频率的增加而增大,从0.1 Hz增加到10 Hz。此外,它们的G’值是G”值的几倍,说明这些水凝胶都能承受外力。同时,Gel V1-Scr/NapFFY的G’值和G”值与Gel V1-Cal/NapFFY的G’值相近,说明Gel V1-Scr/NapFFY和Gel V1-Cal/NapFFY具有相近的机械强度。有趣的是,Gel V1-Scr/NapFFY和Gel V1-Cal/NapFFY的弹性都比Gel NapFFY强,这表明肽（V1-Scr或V1-Cal）与水凝胶NapFFY之间的共组装显著提高了Gel NapFFY的机械强度。圆二色谱（CD）测量表明,Gel NapFFY表现出与Gel V1-Cal/NapFFY或Gel V1-Scr/NapFFY相似的光谱。凝胶NapFFY的CD光谱在202 nm处有显著的Cotton效应,在232 nm处有明显的CD负吸收,表明水凝胶中形成了β二级结构。在Gel V1-Cal/NapFFY或Gel V1-Scr/NapFFY的CD光谱中,在202 nm处有显著的Cotton效应,在220 nm处有明显的CD负吸收。这些结果表明,V1-Cal或V1-Scr的包封几乎不会干扰水凝胶中水凝胶分子的排列。NapFFY的CD光谱也表明,当其浓度低于其CAC时,不形成任何二级结构,而当浓度高于其CAC时,则形成β-sheet二级结构。利用透射电子显微镜（TEM）观察了这三种水凝胶的显微结构。一般来说,所有的水凝胶都由长而柔韧的纳米纤维组成。Gel V1-Scr/NapFFY和Gel V1-Cal/NapFFY之间的纳米纤维密度非常接近。然而,Gel V1-Scr/NapFFY和Gel V1-Cal/NapFFY的纳米纤维密度高于Gel NapFFY,这与以上流变学结果一致,Gel V1-Scr/NapFFY和Gel V1-Cal/NapFFY在机械上强于Gel NapFFY。这些结果表明,肽（V1-Scr或V1-Cal）与NapFFY的共组装不影响形成的水凝胶的微观形貌,但明显提高了相关水凝胶的机械强度。5.水凝胶持续释放V1-Cal或V1-Scr监测通过HPLC分析,通过绘制V1-Cal或V1-Scr肽浓度与其HPLC峰面积的关系,得到了Vl-Cal和Vl-Scr的标准校准曲线。按照上述方法制备Gel V1-Cal/NapFFY或Gel V1-Scr/NapFFY水凝胶后,在200μL Gel V1-Cal/NapFFY或Gel V1-Scr/NapFFY中加入1m L PBS（0.01 M,p H 7.4）,37℃孵育。在不同时间（1、2、3、5、8、14天）收集上清1 m L进行HPLC分析。然后立即用1m L PBS补充培养液。V1-Cal和V1-Scr在14天内连续释放。体外释放监测结果显示,第3天,V1-Cal和V1-Scr的累积释放量分别为27.8±8.4%和24.4±4.8%。V1-Cal和V1-Scr的累积释放量随时间增加而增加,在第14天分别接近62.1±8.2%和60.8±6.1%。肽的释放率在第5天较高,之后随时间逐渐降低。这些实验结果表明,分别从Gel V1-Cal/NapFFY和Gel V1-Scr/NapFFY以可持续的方式释放V1-Cal和V1-Scr,适合MI治疗的体内实验。6.稳定性实验我们进行了多肽在PBS缓冲液（p H 7.4,10 m M）中的稳定性研究。HPLC分析清楚表明,V1-Cal或V1-Scr在PBS中可以稳定到16天。7.细胞毒性评估用水凝胶（Gel NapFFY,Gel V1-Scr/NapFFY或Gel V1-Cal/NapFFY）处理的H9C2细胞的存活率高于0.1 mg/m L肽（V1-Scr或V1-Cal）处理或未处理（对照）的细胞存活率。这表明无论是否共组装肽（V1-Scr或V1-Cal）,NapFFY水凝胶均可促进H9C2细胞的增殖。以上结果表明,V1-Scr、V1-Cal、Gel NapFFY、Gel V1-Scr/NapFFY或Gel V1-Cal/NapFFY与H9C2细胞具有较高的相容性,可用于后续的体内实验。第二部分V1-Cal/NapFFY水凝胶作用于心肌梗死的大鼠在体实验研究材料和方法1.心肌梗死动物模型结扎大鼠左前降支建立心肌梗死模型。Sham组只穿线,不结扎冠状动脉。其余各组均结扎冠状动脉前降支。采用5点心肌注射的方法予以心肌梗死周围区注射,根据组别注射水凝胶、V1-Cal或PBS。每点注射20μL,共注射100μL。2.末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记（Terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated d UTP nick end labelling,TUNEL）实验采用荧光标记原位细胞死亡检测试剂盒（Roche）对术后3天心肌梗死边缘区凋亡细胞进行TUNEL染色分析。3.Western blot心脏样本分别与GAPDH、TRPV1和p-TRPV1一抗在4抗孵育过夜。洗净样品,用辣根过氧化物酶偶联二抗体在37℃条件下孵育1小时。用ECL和放射自显影观察免疫反应蛋白。4.苏木精-伊红染色（Hematoxylin and Eosin（H＆E）staining）心肌梗死模型术后第28天,大鼠主要器官用10%福尔马林固定48 h,石蜡包埋,切成5μm切片进行H＆E染色,光镜观察。5.免疫组织化学染色（Immunohistochemistry staining）免疫组化检测血管生成。血管用抗CD31（GB12063,Servicebio）一抗（1:500）染色。切片用荧光显微镜（Zeiss,German）拍摄。血管生成的定量计算使用Image J软件（NIH）。6.酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）心肌梗死模型术后第1、3、7天取大鼠尾静脉采血。采用相应的ELISA试剂盒检测各组血清中TNF-alpha、IL-6、IL-17A水平。7.超声心动图MI后28天,采用配备18-MHz成像换能器的超声（VINNO 6 VET）进行经胸超声心动图检查。在乳头肌水平记录M型示迹,测量左室射血分数（EF）、缩短分数（FS）、收缩期左室内径（LVIDs）、舒张期左室内径（LVIDd）。8.Masson染色心肌梗死术后第28天处死大鼠,取心脏标本。然后进行Masson染色。使用Image J软件（NIH）分析心肌梗死面积、左心室壁厚度、边界区纤维化程度。结果1.心肌梗死大鼠的凋亡、炎症因子和TRPV1表达分析V1-Cal和V1-Cal/NapFFY均能显著缓解边界区细胞凋亡,且后者效果优于前者。MI组凋亡细胞百分率为3.8±0.5%,V1-Cal组为2.1±0.3%,V1-Cal/NapFFY组为0.8±0.2%。总体而言,V1-Cal/NapFFY对细胞凋亡的保护作用强于V1-Cal。与假手术组比较,其他五组大鼠心肌梗死后第1、3天TNF-α、IL-6表达水平均显著升高,IL-17A在心肌梗死后第7天达到较高水平。与MI组、NapFFY组和V1-Scr/NapFFY组相比,V1-Cal组和V1-Cal/NapFFY组大鼠这三种炎症因子的表达水平均明显降低,说明V1-Cal或Gel V1-Cal/NapFFY治疗均能有效抑制MI中这三种炎症因子的升高。Gel V1-Cal/NapFFY对这些炎症因子的抑制作用最佳。与Sham组相比,MI组大鼠边界区总TRPV1水平和p-TRPV1水平分别升高了3.6倍和3.1倍。但与MI组相比,V1-Cal和V1-Cal/NapFFY组总TRPV1和p-TRPV1表达明显降低,说明V1-Cal和Gel V1-Cal/NapFFY均抑制了总TRPV1和p-TRPV1表达的升高。在四组中,Gel V1-Cal/NapFFY对总TRPV1和p-TRPV1表达的抑制最强。2.心脏功能与假手术组相比,心肌梗死大鼠在心肌梗死后4周末出现明显的心室功能不全,超声心动图显示心室壁运动异常。但经Gel V1-Cal/NapFFY治疗后,心肌梗死大鼠心室功能障碍明显恢复。超声心动图参数测量结果显示,与假手术组相比,心肌梗死大鼠左室射血分数（EF）和缩短分数（FS）明显降低,左室收缩期末内径（LVIDs）和左室舒张期末内径（LVIDd）增加。定量分析显示,经Gel V1-Cal/NapFFY治疗4周后,心肌梗死大鼠的EF值由48.9±4.1%提高到73.6±3.3%。3.促血管生成对典型的血管内皮标志物CD31+进行免疫组化染色。与假手术组比较,心肌梗死组大鼠CD31+面积百分比增加。但与MI组相比,V1-Cal或Gel V1-Cal/NapFFY组CD31+面积百分比明显升高。同样,在5个处理组中,Gel V1-Cal/NapFFY组拥有最高的CD31+面积百分比。4.心室重构Gel V1-Cal/NapFFY和V1-Cal治疗可抑制纤维化和心室重构,但Gel NapFFY或Gel V1-Scr/NapFFY则不能。结果表明,经V1-Cal/NapFFY凝胶处理后心肌梗死面积由41.0±5.0%减小到22.0±2.4%,纤维化面积由20.8±3.3%减小到5.9±1.6%,心肌壁厚度由708.0±121.2μm增大到1297.7±185.4μm。再次,V1-Cal对心肌梗死大鼠也显示出重塑减缓作用,但不如凝胶V1-Cal/NapFFY有效。一致的是,凝胶NapFFY和凝胶V1-Scr/NapFFY治疗均未显示心肌梗死大鼠重构减轻作用。5.体内V1-Cal的持续释放最后,我们用同位素标记法评估了凝胶V1-Cal/NapFFY的体内释放量。首先,在氯胺T和Na125I的存在下,用125I标记V1-Cal中的酪氨酸（Y）。然后用125I-V1-Cal和NapFFY按照上述方法制备水凝胶。每只大鼠沿梗死区5点注射125I标记的水凝胶,术后第1天和第3天监测心、血、肝、脾、肺、肾的125I水平,计算体内V1-Cal的释放和代谢。体内释放监测结果显示,125I-V1-Cal在大鼠心脏的残留量在第1天和第3天分别为50.7±4.7%和16.8±5.4%,在所有研究组织和器官中保持最高浓度。注射后第1天和第3天125I-V1-Cal在血液和其他组织（肝、脾、肺、肾）中的分布定量统计结果。结果表明,除心脏外,肺的V1-Cal浓度次之,其次是血液、肾脏、脾脏和肝脏。以上实验结果证明了V1-Cal在体内以可持续的方式缓慢从凝胶V1-Cal/NapFFY中释放出来。6.体内安全性研究为了进一步评估我们的水凝胶的全身毒性,治疗后,我们取大鼠的主要器官（肝、脾、肺和肾）进行H＆E染色。与对照组相比,这5个实验组的器官均未见明显病理改变。这些结果表明,水凝胶具有较高的生物安全性,适合在体内应用。结论综上所述,为了更有效地减少心肌梗死大鼠模型的心室重构和改善心功能,我们将治疗性肽V1-Cal与研究充分的水凝胶NapFFY共同组装,制备用于持续释放的超分子水凝胶V1-Cal/NapFFY。水凝胶V1-Cal/NapFFY的流变力学和TEM测试表明,V1-Cal与NapFFY的共组装增加了凝胶NapFFY的机械强度,使凝胶V1-Cal/NapFFY更适合心肌注射治疗心肌梗死。凝胶V1-Cal/NapFFY的V1-Cal体外累积释放谱显示,凝胶V1-Cal/NapFFY可持续释放V1-Cal 2周以上。细胞毒性和增殖实验结果表明,Gel V1-Cal/NapFFY对H9C2细胞无毒,但对其增殖有刺激作用。体内实验结果表明,在5个实验组中,Gel V1-Cal/NapFFY对心肌梗死模型大鼠TRPV1表达和活化的降低、细胞凋亡的减少和炎症因子的释放效果最好。此外,Gel V1-Cal/NapFFY对改善心功能、逆转心肌梗死后纤维化及心肌梗死后心肌重构的效果最好。我们设想我们的Gel V1-Cal/NapFFY在不久的将来可用于临床减少心室重构,改善心肌梗死后心功能。