研究背景:骨肉瘤(osteosarcoma)是一种由间叶细胞发展而来的高度恶性肿瘤,是我国青少年最常见的恶性肿瘤之一,占原发性骨肿瘤的17%。这种恶性肿瘤以能产生在组织学上分化完全的或分化不完全的类骨质样组织为特征。骨肉瘤往往呈局部浸润性、侵袭性生长,早期即发生转移。一般认为,骨肉瘤分为普通型,毛细血管扩张型,骨膜外型,骨膜型,低级中心型,小细胞型,其他非典型类型等等。各个类型都有其各自组织形态学上的特点。近年来,随着现代化的,个体化的大剂量化学药物联合外科手术疗法,使得原位性,非转移性骨肉瘤患者的5年存活率达到了60-70%。然而,对于转移性骨肉瘤和复发性骨肉瘤的诊疗,结果仍然差强人意。病因不明确,肿瘤自身复杂的基因突变性、广泛的组织差异性、缺乏特定的生物标记性、高侵袭性等一系列问题使得人类对于骨肉瘤的生物学特性的认知仍然面临着各种挑战。目前,人们对骨肉瘤的研究与探索主要集中在发病的分子机制,尤其是疾病发展过程中各种有代表性的分子标记物和治疗基因靶点等方面。所以,从基因水平上探索骨肉瘤疾病的发生发展规律和病理机制;探寻新的特异性强,灵敏度高的分子标记位点对于诊断和防治显得尤为重要。Micro RNAs(mi RNAs)是一类长度在18-25bp,单链、非编码小RNA,可通过转录和转录后水平,与对应的m RNA的3’UTR结合,调控多种基因的转录过程,通过从分子层面来影响多种肿瘤细胞的生长来介导肿瘤疾病的发生,发展和转归。最新有报道表明,mi R-17-5p在多种肿瘤细胞中高表达,如肺癌、乳腺癌、膀胱癌、直肠癌、胃癌、肝癌和骨肉瘤。然而,关于mi R-17-5p对骨肉瘤细胞的各项生理功能的影响及其分子生物学的发生机制尚未见有所报道。因此,我们人工合成了mi R-17-5p的抑制物(mi R-17-5p inhibitor),探讨mi R-17-5p inhibitor对人骨肉瘤细胞的迁移,侵袭,增殖、凋亡等各项细胞生理功能的影响,揭示其发生,发展的作用机制和原理,为骨肉瘤疾病的临床诊疗提供分子生物学的理论基础,为此种肿瘤疾病供新的认知角度。研究目的本次实验研究收集骨肉瘤患者手术中的骨肉瘤组织和紧邻骨肉瘤的肿瘤旁边的病理组织为标本,探究骨肉瘤组织及其骨肉瘤旁边组织中mi R-17-5p和SRCIN1基因表达水平的差异。人工培养人骨肉瘤细胞株MG63,观察转染mi R-17-5p inhibitor基因后对骨肉瘤迁移、侵袭、增殖、凋亡等各项细胞生理功能的影响;探索mi R-17-5p的靶标蛋白及其分子层面的调控机制,探寻新的mi RNA,为新的mi RNA在骨肉瘤的防治作用提供基础研究支持及新靶点的探讨。方法1.收集郑州大学第一附属医院(2015年1月至2016年9月期间)不同骨肉瘤患者骨肉瘤组织及对应骨肉瘤旁边组织标本共计28例,于-80℃冰箱中存放备用。利用实时定量荧光PCR(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)技术手段检测这28例骨肉瘤病理组织,骨肉瘤旁边的病理组织中mi R-17-5p及SRCIN1基因的m RNA的表达水平的差异,对比出二者之间的差异,分析二者间有无相关性。使用免疫印迹法(Western blot)实验方法,检测SRCIN1蛋白在骨肉瘤组织和骨肉瘤肿瘤旁边病理组织中的蛋白水平的表达情况。2.采用RT-q PCR检测技术分别检测人成骨细胞株h FOB1.19和人骨肉瘤细胞株MG63中mi R-17-5p的SRCIN1蛋白基因的m RNA表达情况。3.人工合成mi R-17-5p inhibitor agomir和mi R-17-5p inhibitor negative control,并通过脂质体转染法将其转染入骨肉瘤细胞株MG63中。实验分组如下:(1)mi R-17-5p inhibitor组:转染mi R-17-5p inhibitor agomir。(2)NC组:转染mi R-17-5p inhibitor negative control。(3)Blank组:只转染进去脂质体试剂。4.采用CCK-8实验方法,法检测三组MG63细胞增殖情况,观测三组实验细胞的增殖情况是否存在差异性。5.采用流式细胞术和Tunel实验技术,对比观测三组骨肉瘤细胞MG63的凋亡是否存在差异性。6.利用细胞划痕实验,观测三组骨肉瘤细胞MG63的迁移能力是否存在差异性。7.通过Transwell实验方法,观测三组骨肉瘤细胞MG63的侵袭能力是否产生李差异性。8.运用Target Scan软件和mi Randa信息库的生物信息学软件对mi R-17-5p的作用靶标进行预测。根据预测结果构建出含有SRCIN1的3’UTR区的野生型和突变型的人工重组双荧光素酶基因学载体,分成两组,分别将其与mi R-17-5p agomir和mi R-17-5p negative control一起转染入人骨肉瘤细胞株MG63中,并利用Western blot实验检测技术和双荧光素酶报告技术原理,证实SRCIN1蛋白正是mi R-17-5p的作用靶标目的蛋白。9.采用Western blot实验原理,检测三组细胞中SRCIN1的表达情况。结果1.与骨肉瘤瘤旁边组织相比,在骨肉瘤病理组织中,mi R-17-5p的相对含量升高明显(P<0.01);SRCIN1的m RNA相对含量下降明显(P<0.01)。骨肉瘤病理组织中SRCIN1的蛋白表达水平较骨肉瘤旁边的病理组织明显降低。2.在人骨肉瘤细胞株MG63中,mi R-17-5p的表达明显高于成骨细胞h FOB1.19(P<0.01),SRCIN1的m RNA表达明显低于成骨细胞h FOB1.19(P<0.01)。3.转染mi R-17-5P inhibitor agomir后,mi R-17-5p inhibitor转染组的mi R-17-5p表达水平显著低于NC组和Blank组,其差异具有统计学意义(P<0.01)。结果表明骨肉瘤细胞在转染mi R-17-5p inhibitor后,mi R-17-5p的表达水平明显降低。4.在CCK-8(Cell Counting Kit)细胞增殖实验中,与NC组和Blank组相比较,转染mi R-17-5P inhibitor实验组中,骨肉瘤细胞在OD450处的吸光光度值明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05);而NC组和Blank组间相比较后发现,两组骨肉瘤细胞的吸光光度数值间的差异不大,差异没有统计学意义(P>0.05)。5.流式细胞技术和Tunel实验检测细胞凋亡结果显示,与NC组和Blank组比较,转染mi R-17-5p inhibitor实验组的骨肉瘤细胞的细胞凋亡率明显高于NC组和Blank组,其间的差异具有统计学意义(P<0.01),而NC组和Blank组间骨肉瘤细胞的凋亡率差别不大,差异没有统计学意义(P>0.05)。6.Transwell实验的结果表明,与NC组和Blank组相比较,转染mi R-17-5P inhibitor实验组,其穿过基底膜的骨肉瘤细胞数明显相对较少,其差异具有统计学意义(P<0.05)。NC组和Blank组穿过基底膜的细胞数大致相当,期间的差异无统计学意义(P>0.05)。7.划痕实验结果表明,与NC组和Blank组比较,转染mi R-17-5p实验组的细胞的迁移能力较NC组和Blank明显下降;而NC组和Blank组相比较,细胞的迁移能力相近,无显著性差异。8.Western blot检测实验和免疫双荧光素酶报告实验结果显示,SRCIN1蛋白是mi R-17-5p的作用靶标蛋白。9.Western blot检测实验结果表明,转染mi R-17-5p inhibitor agomir的实验组与NC组和Blank组比较,SRCIN1的蛋白表达水平较明显升高,而NC组与Blank组比较,两组细胞中SRCIN1的蛋白表达无差异性。结论1.在骨肉瘤病理组织和骨肉瘤细胞中,mi R-17-5p异常高表达,SRCIN1低表达。2.mi R-17-5p通过作用于SRCIN1的3’UTR区,负向调控其表达水平来发挥其生物学上的作用。3.在骨肉瘤细胞中,mi R-17-5p的表达下调能够有效抑制骨肉瘤细胞的迁移、侵袭,增殖能力,并促进骨肉瘤细胞的凋亡,发挥出对骨肉瘤的抑制作用。