利用CRISPR/Cas9技术创建甘蓝型油菜MIKCC型MADS-box基因的突变体库

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甘蓝型油菜(Brassica napus)是我国重要的油料作物之一,其花器官的发育与产量密切相关。MADS-box基因家族参与调控植物的营养生长、生殖生长及衰老死亡,对植物生长发育十分重要。MIKCC型基因是MADS-box基因家族II型基因的一个亚家族,花器官发育ABCDE模型中的基因大都属于MIKCC亚家族,该亚家族对于花器官的发育十分重要。目前,拟南芥MIKCC亚家族基因的功能已基本清楚,但对甘蓝型油菜MIKCC亚家族基因的基因功能研究还很少。本研究创建了甘蓝型油菜MIKCC亚家族基因的突变体库,并对部分MIKCC亚家族基因的功能进行了初步研究,取得的主要研究结果如下:通过分析甘蓝型油菜MIKCC亚家族基因的核苷酸序列,针对74个MIKCC亚家族基因设计了多靶向60条sg RNA,构建了30个双sg RNA的基因编辑载体。将3-5个或30个不同载体的农杆菌菌株混合,转化油菜品种Westar,共得到1428株转化植株,Cas9阳性单株数为961株(67.30%)。用载体特异引物扩增sg RNA区段并进行高通量测序,共在355个转基因植株中检测到20种sg RNA,来源于20个不同载体,共靶向55个MIKCC亚家族基因。通过数据比对发现30个菌株混池转化的Cas9阳性率、sg RNA检测率和单植株多重载体转入占比较3-5菌株混池高。对转化群体进行表型观察,发现310株植株表型突变,302株(97.42%)突变表型与花器官发育相关,主要表现为花器官数量、形态或功能变异,说明转化群体覆盖的55个MIKCC亚家族基因的基因功能大多与花器官发育有关。本研究针对3种表型,进行基因型鉴定。表型一:花器官提早终止分化(15株),与2个AGL1(SHP1)同源基因的突变有关,结合基因的表达量推测AGL1基因参与调控花器官的分化及配子或胚胎的发育,是甘蓝型油菜繁殖后代不可缺少的重要基因,发挥花器官发育的ABCDE模型中D类基因的功能;表型二:单萼片内五蕾(“花嵌花”)的突变体(1株),与3个AGL2(SEP1)同源基因的突变有关,结合基因的表达量推测AGL2基因参与雌蕊和花瓣的身份及位置的确定,同时决定雌蕊的育性,发挥花器官发育的ABCDE模型中E类基因的功能;表型三:角果缩短并提前开裂(3株),与4个AGL8(FUL)同源基因的突变有关,T1代植株表型分离,植株的角果长随着AGL8同源基因被编辑的数量增多而逐渐变短。结合基因的表达量推测AGL8基因具有抗荚裂功能,其多个同源基因存在微效累加效用。
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