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研究背景及目的：脓毒症(Sepsis)是临床上一种常见的危重病症，是指由感染引起的全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，具有发病率高、死亡率高的特点。作为革兰氏阴性菌细菌细胞壁外层的主要成分之一的内毒素(Lipopolysaccharide,LPS)除了能引发脓毒症外，还可通过诱导“内毒素耐受”，降低各种原因引起的炎症反应，从而预防潜在脓毒症的发生。内毒素耐受是指动物或免疫细胞等在给予小剂量LPS预处理后，对LPS再次刺激时无反应或反应性明显降低。因此，寻找一种可诱导内毒素耐受同时又不诱导机体产生炎性反应的药物是抗感染及抗炎药物研究的新策略。环状鲎肽(Cyclic limulus peptide，CLP-19)是经美洲鲎抗内毒素因子(Limulusanti-lipopolysaccharide factor, LALF)结构改造后得到的一条无溶血性、对巨噬细胞等无致炎作用的环肽，具有较理想中和LPS及抗菌活性。课题组前期研究表明，提前给予CLP-19可显著降低血清肿瘤坏死因子-α (Tumour Necrosis Factor, TNF-α)水平、提高大肠杆菌致急性腹膜炎模型鼠的生存率；预防性给予CLP-19能显著减少大肠杆菌致急性腹膜炎模型鼠体内的细菌量。在细胞水平，CLP-19预刺激30min后，以磷酸盐缓冲盐水(Phosphate buffered saline, PBS)清洗细胞，再用LPS进行刺激，结果发现，CLP-19预处理组同样可显著降低LPS刺激所引起的TNF-α的升高。上述现象表明，CLP-19可诱导“内毒素耐受”，然而其机制有待深入研究。因此，为明确CLP-19诱导内毒素耐受效应及分子机制，本实验通过建立RAW264.7细胞内毒素耐受模型，利用逆转录聚合酶链式反应(Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction, RT-PCR)、免疫印迹法(Western Blotting, WB)等比较研究巨噬细胞炎症信号通路中关键因子的mRNA及蛋白的变化，初步探讨CLP-19诱导内毒素耐受的分子机制。通过以上研究，拟明确CLP-19诱导小鼠“内毒素耐受”的作用及其途径，并为其用于脓毒症预防提供理论依据。实验方法：第一部分：CLP-19诱导内毒素耐受的时间效应和剂量效应研究1. ELISA分析LPS诱导内毒素耐受的时间效应和剂量效应不同浓度(0ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、7ng/ml、10ng/ml)的LPS作用于RAW264.7细胞，培养不同时间(10h、20h、24h)后，新鲜培养基培养2h，再给予10ng/ml的LPS作用于细胞，4h后取上清液，酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)观察不同时间、不同剂量下TNF-α的表达量，从而确定LPS诱导内毒素耐受的最佳时间和剂量。2. ELISA分析CLP-19诱导内毒素耐受的时间效应和剂量效应用不同浓度(0μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)的CLP-19作用于RAW264.7细胞，培养不同时间(10h、20h、24h)后，新鲜培养基培养2h，再加入LPS使其终浓度为10ng/ml，4h后取上清液，测定不同时间、不同剂量下TNF-α的表达量和IL-10的表达量，从而确定CLP-19诱导内毒素耐受的最佳时间和剂量。以LPS诱导内毒素耐受的最佳时间和剂量为对照组。3. CLP-19诱导内毒素耐受后IL-6和IL-10表达变化分别以5ng/ml LPS、50μg/ml CLP-19孵育细胞20h，用PBS反复清洗后以新鲜培养基培养2h，再加入LPS使其终浓度为10ng/ml，4h后取上清液测定IL-6和IL-10表达变化。第二部分：CLP-19诱导RAW264.7内毒素耐受的分子机制研究1. CLP-19诱导内毒素耐受后胞内TLR4、myD88、TRAF6的mRNA表达变化用50μg/ml CLP-19预处理细胞20h，再用培养基培养2h，向各组中均加入10ng/mlLPS处理细胞不同时间(0h、1h、3h、6h、12h)后，提取细胞RNA，通过RT-PCR检测细胞因子Toll样受体4(Toll like receptor, TLR4)、髓样细胞分化因子88(mydoidMyD88，MyD88)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor-associated factor6，TRAF6)的mRNA变化。以培养基和5ng/ml LPS预处理作为对照。2. CLP-19诱导内毒素耐受后胞内和胞膜TLR4的蛋白表达变化用50μg/ml CLP-19预处理细胞20h，用培养基培养2h后，再向各组中加入10ng/mlLPS作用4h后，分别提取胞膜和胞内蛋白，Western Blot检测胞膜和胞内TLR4蛋白的表达变化。以培养基预处理作为对照。3. CLP-19诱导内毒素耐受后P38的磷酸化水平变化用50μg/ml CLP-19预处理细胞20h，用培养基培养2h后，向各组中均加入10ng/mlLPS分别作用不同时间(0min、10min、30min、60min)后，提取细胞总蛋白，Western Blot检测促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路中P38的磷酸化水平。以培养基和5ng/ml LPS预处理作为对照。4. CLP-19诱导内毒素耐受后Iκ-B的蛋白表达变化用50μg/ml CLP-19预处理细胞20h，用培养基培养2h后，再向各组中加入10ng/mlLPS作用不同时间(0min、5min、15min、30min、60min)后，提取细胞总蛋白，WesternBlot检测核因子κB抑制蛋白(I-kappa-B，IκB)的蛋白表达变化。以培养基预处理作为对照。结果：第一部分：CLP-19诱导内毒素耐受的时间效应和剂量效应研究5ng/ml LPS预处理RAW264.7细胞20h为LPS诱导内毒素耐受的最佳剂量和时间。50μg/ml CLP-19预处理RAW264.7细胞20h为CLP-19诱导内毒素耐受的最佳剂量和时间。50μg/ml CLP-19预处理巨噬细胞20h后，炎症因子IL-6表达下调，抗炎因子IL-10表达增加，与培养基预处理组相比，均有显著差异(P<0.01)。第二部分：CLP-19诱导RAW264.7细胞内毒素耐受的分子机制研究1. CLP-19诱导内毒素耐受后胞内TLR4、myD88和TRAF6的mRNA表达变化RT-PCR结果显示，与培养基预处理细胞组比较，CLP-19预处理细胞组中，随着刺激时间的延长，TLR4mRNA表达下调，差异有统计学意义(P<0.01)。而MyD88和TRAF6的mRNA表达均无明显变化(P﹥0.05)。2. CLP-19诱导内毒素耐受后胞内和胞膜TLR4蛋白表达降低Western Blot结果显示，与培养基预处理组相比，CLP-19诱导的内毒素耐受组中，胞膜和胞内TLR4的蛋白表达均下调，有显著差异(P<0.05)。3. CLP-19诱导内毒素耐受后MAPK通路中P38的磷酸化被抑制Western Blot结果显示，培养基预处理细胞组中，P38的磷酸化水平在刺激15min后明显增加，30min后达到高峰。与培养基预处理细胞组相比，CLP-19诱导的耐受组中，P38的磷酸化水平均被显著抑制(P<0.01)。4. CLP-19诱导内毒素耐受后IκB未被降解Western Blot结果显示，培养基预处理细胞组中，IκBα在大剂量LPS刺激30min内迅速降解，IκBβ在大剂量LPS刺激60min后迅速降解。与培养基预处理细胞组相比，CLP-19诱导的耐受组中，IκBα和IκBβ表达水平有显著差异(P<0.01)。结论：1.50μg/ml CLP-19预处理RAW264.7细胞20h为CLP-19诱导内毒素耐受的最佳剂量和时间。2.鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19可通过降低TLR4在胞膜和胞内的表达诱导内毒素耐受。3.鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19可通过抑制P38磷酸化诱导内毒素耐受。4.鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19可抑制IκBα和IκBβ的降解，从而抑制NF-κB转位进入胞核，进而诱导内毒素耐受。