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目的:构建脊髓星形胶质细胞(astrocytes,ASTs)氧糖剥夺/复氧复糖(Oxygen-glucose deprivation/restoration,OGD/R)模型,观察Ⅵ型胶原蛋白A1(ⅥCollagen,COL6A1)在脊髓星形胶质细胞OGD/R后的表达变化及对自噬的影响,进一步探讨敲低COL6A1对大鼠脊髓星形胶质细胞OGD/R损伤后自噬的调节作用及机制。方法:提取培养新生SD大鼠(1-3 d)脊髓星形胶质细胞,免疫荧光染色鉴定其纯度;构建脊髓星形胶质细胞OGD/R模型;RT-qPCR检测COL6A1 m RNA的差异性表达;通过shRNA敲低实验,检测转染shRNA-COL6A1后COL6A1 m RNA的表达水平。实验分为6组:正常对照(Control)组:大鼠脊髓星形胶质细胞正常培养,不予特殊处理;氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)组:大鼠脊髓星形胶质细胞氧糖剥夺6 h,复氧复糖24 h;OGD/R+shRNA-NC(sh-NC)组:在OGD/R组基础上,转染慢病毒对照;OGD/R+shRNA-COL6A1(sh-COL6A1)组:在OGD/R组基础上,转染慢病毒;OGD/R+shRNA-COL6A1+PI3K抑制剂(LY294002)(sh-COL6A1+LY294002)组:在sh-COL6A1组基础上,加入LY294002共同培养;OGD/R+shRNA-COL6A1+自噬抑制剂(3-MA)(sh-COL6A1+3-MA)组:在sh-COL6A1组基础上,加入3-MA共同培养。CCK-8检测敲低COL6A1对OGD/R后脊髓星形胶质细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测敲低COL6A1对OGD/R后脊髓星形胶质细胞凋亡的影响;透射电镜观察敲低COL6A1脊髓星形胶质细胞OGD/R后自噬小体的变化;RT-qPCR检测敲低COL6A1对脊髓星形胶质细胞OGD/R后自噬相关因子表达的影响;Western blot检测敲低COL6A1对脊髓星形胶质细胞OGD/R后自噬和PI3K/Akt通路相关蛋白表达的影响。结果:1.RT-qPCR结果表明,与正常对照组相比,脊髓星形胶质细胞OGD/R后COL6A1 m RNA表达水平显著提高;敲低COL6A1后,与sh-NC组相比,COL6A1m RNA表达水平明显下降;2.CCK-8实验结果显示,与Control组相比,OGD/R组细胞增殖在72 h内受到明显抑制;与OGD/R组相比,sh-COL6A1组细胞增殖能力在72 h内显著增强;3.流式细胞术结果显示,与Control组相比,OGD/R组细胞凋亡比例显著升高;与OGD/R组相比,sh-COL6A1组细胞凋亡比例明显降低;而加入PI3K抑制剂LY294002和自噬抑制剂3-MA后,细胞凋亡又有所增加;4.透射电镜结果显示,OGD/R组可见少量自噬小体,sh-COL6A1组自噬小体显著增多,而应用PI3K抑制剂LY294002和自噬抑制剂3-MA后自噬小体又减少;5.RT-qPCR结果显示,与Control组相比,OGD/R组中Beclin-1 m RNA、LC3m RNA表达水平上升;敲低COL6A1后Beclin-1 m RNA、LC3 m RNA表达水平进一步上升,而PI3K抑制剂LY294002和自噬抑制剂3-MA抑制了shRNA-COL6A1的作用。6.Western blot检测显示,敲低COL6A1后Beclin-1蛋白表达水平和LC3Ⅱ/Ⅰ比值上升,PI3K抑制剂LY294002和自噬抑制剂3-MA抑制了shRNA-COL6A1的作用。敲低COL6A1后p-PI3K、p-Akt的蛋白表达水平显著升高,应用PI3K抑制剂LY294002和自噬抑制剂3-MA后降低。结论:1.脊髓星形胶质细胞OGD/R后,COL6A1表达增高,细胞凋亡增加;2.敲低COL6A1可以激活OGD/R后大鼠脊髓星形胶质细胞的自噬程度,提高细胞的活力,降低细胞凋亡;3.敲低COL6A1可能通过激活PI3K/Akt信号通路激活自噬减轻大鼠脊髓星形胶质细胞OGD/R损伤。因此,本研究有望在应激状态下通过降低COL6A1,促使自噬小体形成改善细胞生存环境,对SCI治疗有重要的指导意义。