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第一部分临床研究：急性心肌梗死(AMI)热毒证素分布规律
目的：
归纳AMI患者证素分布规律，着重研究热毒证素的分布特点，为更好地指导临床提供依据。
方法：
本部分研究采用回顾性分析方法，收集2016年1月——2019年1月期间因急性心肌梗死(AMI，Acute myocardial infarction)收住我院心内科患者的症状、体征及住院期间相关实验室检查等资料，建立数据库并对资料进行统计分析。在采集、整理资料之前，对参与人员进行统一培训，保证资料采集的一致性和可靠性。
结果：
1.本研究共纳入有效病例358例，其中ST段抬高型心肌梗死(STEMI)242例，占67.7%，非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)116例，占32.4%；男性患者282例，占78.8%，女性患者76例，占21.2%，且男性患者和女性患者在各年龄段分布有统计学差异(P＜0.01)；吸烟患者143例，占39.9%，饮酒患者18例，占5.0%，高血压患者202例，占56.4%，糖尿病患者116例，占32.4%，高总胆固醇患者125例，占34.9%，高甘油三酯患者100例，占27.9%，高低密度脂蛋白患者150例，占41.9%，且吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、高甘油三酯患者在各年龄段分布中存在统计学差异(P＜0.01;P＜0.05)，高胆固醇、高低密度脂蛋白患者在各年龄段分布中无统计学意义(P＞0.05)，吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、高胆固醇患者在男女中的分布存在统计学差异(P＜0.01;P＜0.05)；高甘油三酯、高低密度脂蛋白患者在男女中的分布无统计学意义(P＞0.05)。
2.本研究证素分布情况：病位证素中，心348例，占97.2%，肺81例，占22.6%，肝46例，占12.8%，脾44例，占12.3%，肾18例，占5.0%；病位证素组合中，心+肺76例，占21.2%，心+肝43例，占12.0%，心+脾41例，占11.5%，心+肾16例，占4.5%，肺+脾5例，占1.4%，肺+肾4例，占1.1%，心+肾+脾3例，占0.8%，心+脾+肺3例，占0.8%；病性证素中热毒194例，占54.2%，痰浊192例，占53.6%，血瘀154例，占43.0%，气虚71例，占19.8%，阴虚44例，占12.3%，气滞36例，占10.1%，阳虚18例，占5.0%，寒凝5例，占1.4%；病性证素组合中，热毒+痰浊97例，占27.1%，痰浊+血瘀67例，占18.7%，热毒+血瘀57例，占15.9%，痰浊+气虚33例，占9.2%，血瘀+气滞26例，占7.3%，血瘀+气虚21例，占5.9%，阴虚+痰浊20例，占5.6%，气虚+阴虚19例，占5.3%，热毒+血瘀+痰浊17例，占4.7%，热毒+阴虚16例，占4.5，痰浊+气滞11例，占3.1%，热毒+气虚11例，占3.1%。病位证素及病性证素进行聚类分析后呈现出以下证素组合规律：病位证素心、肺和病性证素热毒、痰浊、血瘀关联性大，病位证素脾和病性证素气虚、阴虚关联性大，病位证素肾和病性证素阳虚关联性大，病位证素肝和病性证素气滞关联性大。
3.本研究热毒证素分布规律：热毒证素与STEMI分布、吸烟、饮酒呈正相关，且有统计学意义(P＜0.01;P＜0.05)；热毒证素与年龄成负相关，且有统计学意义(P＜0.01)；热毒证素与性别因素无统计相关性(P＞0.05)；热毒证素与高甘油三酯呈正相关，且有统计学意义(P＜0.05)；热毒证素与高血压、糖尿病、高总胆固醇、高低密度脂蛋白等因素无统计相关性(P＞0.05)。热毒证素与病位证素心呈正相关，且有统计学意义(P＜0.05)；热毒证素与病位证素肝、脾、肾等呈负相关，且有统计学意义(P＜0.01)；热毒证素与病位证素肺呈正相关性，但无明显统计学差异(P＞0.05)；热毒证素与病性证素血瘀、寒凝、气滞、气虚、阴虚、阳虚呈负相关，且有统计学意义(P＜0.01;P＜0.05)；热毒证素与病性证素痰浊呈负相关，但无明显统计学差异(P＞0.05)。
结论：
AMI病位证素以心为主，病位证素组和以心+肺、心+肝、心+脾为主；病性证素中实证证素较多，虚性证素较少，实证证素中主要是热毒、血瘀、痰浊，其中热毒证素出现频率最高，虚性病素以气虚为主；病性证素组和以热毒+痰浊、痰浊+血瘀、热毒+血瘀为主，说明AMI病机虽为本虚标实，但以标实为主。热毒证素与STEMI、吸烟、饮酒、高甘油三酯、病位证素心呈正相关，与年龄因素呈负相关，发病患者越年轻，出现热毒证素机率越高，治疗上应重视清热解毒。
第二部分实验研究：基于miR-21介导自噬信号通路探讨清热解毒法干预AS的研究
目的：
从miR-21介导信号通路MAPK/mTOR调控自噬水平的角度，探讨清热解毒法干预动脉粥样硬化(AS)的细胞分子机制。
方法：
1.采用液相-质谱联用的方法对清热解毒代表方黄连解毒汤冻干粉进行定性、定量检测。
2.培养巨噬细胞系THP-1细胞，采用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导其成为泡沫细胞，观察其自噬水平、miR-21及MAPK/mTOR信号通路中相关分子的表达情况，以及黄连解毒汤的干预作用。在倒置显微镜下观察THP-1细胞形态；采用实时无标记细胞分析(RTCA)法检测THP-1细胞增殖情况，筛选ox-LDL及黄连解毒汤冻干粉(HL)溶液的最佳干预浓度及时间；通过油红O染色观察巨噬细胞泡沫样变水平，证实造模成功；采用透射电镜和蛋白质免疫印迹(Western blot，Wb)法检测正常组(N)、模型组(M)、HL组自噬小体和自噬蛋白LC3B、P62的表达差异；采用实时荧光定量PCR(qPCR)法观察miR-21的表达情况；采用Wb和qPCR法检测MAPK/mTOR信号通路蛋白和mRNA的表达情况。
3.将miR-21mimics/miR-21inhibitor转染至THP-1源性泡沫细胞，制备miR-21过表达/表达受抑的细胞模型，并用HL溶液对其进行干预。观察自噬蛋白LC3B、P62及MAPK/mTOR通路蛋白和mRNA的表达情况。检测方法同上。
结果：
1.定性检测出黄连解毒汤冻干粉含有巴马汀、杜仲醇、大黄酸、小檗碱等27种成分；定量检测其中七种成分含量为小檗碱0.55mg/g、黄连碱0.72mg/g、栀子苷5.02mg/g、黄柏碱0.46mg/g、表小檗碱2.98mg/g、巴马汀1.92mg/g、黄芩苷0.87mg/g。
2.RTCA实时检测表明ox-LDL浓度在160μg/ml及以下时细胞增殖不受影响，且40μg/ml浓度干预24h时观察自噬水平较正常组(N)出现明显下降，差异有统计学意义(P＜0.01;P＜0.05)；RTCA实时检测表明HL浓度在96μg/ml及以下时细胞增殖不受影响，用96μg/mlHL干预泡沫细胞观察不同时间点自噬水平变化，结果表明干预2h时自噬水平较模型组(M)明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)；分别用24μg/ml、48μg/ml、96μg/mlHL干预泡沫细胞2h，三个干预组较模型组(M)自噬水平均升高，且96μg/mlHL干预时自噬水平升高有统计学差异(P＜0.01;P＜0.05)；；细胞油红O染色表明，M组与N组相比脂质含量明显增多，HL组较M组明显减少;透射电镜检测自噬体表明，M组较N组相比自噬小体明显减少，HL组较M组相比自噬小体明显增多。
3.与N组相比，M组miR-21表达降低(P＜0.01)；与M组相比，HL组miR-21表达升高(P＜0.01)。与N组相比，M组MAPK/mTOR信号通路蛋白和mRNA的表达升高(P＜0.01;P＜0.05)；与M组相比，HL组MAPK/mTOR信号通路蛋白和mRNA的表达降低(P＜0.01;P＜0.05)。
4.与MAPK-WT+NC组相比，MAPK-WT+miR-21组荧光值明显下降(P＜0.01)；MAPK-MUT+NC组相比，MAPK-MUT+miR-21组荧光值无明显变化(P＞0.05)。与N组相比，M组miR-21水平及自噬水平明显降低(P＜0.01)；与miR-21mimics阴性对照(mimic NC)组相比，miR-21mimics组miR-21表达及自噬水平明显升高(P＜0.01;P＜0.05)；与miR-21inhibitor阴性对照(inhibitor NC)组相比，miR-21inhibitor组miR-21表达及自噬水平明显下降(P＜0.01;P＜0.05)；与N组相比，M组MAPK/mTOR信号通路蛋白水平明显上调(P＜0.01)；与mimicNC组相比，miR-21mimics组MAPK/mTOR信号通路蛋白表达明显降低(P＜0.01)；与inhibitorNC组相比，miR-21inhibitor组MAPK/mTOR信号通路蛋白表达明显升高(P＜0.01;P＜0.05)。
5.与N组相比，M组miR-21水平及自噬水平显著下降(P＜0.01;P＜0.05)；与M组对比，HL组miR-21水平及自噬水平显著上升(P＜0.01;P＜0.05)；与HL组相比，miR-21mimics阴性对照(mimic NC)组和miR-21inhibitor阴性对照(inhibitor NC)组miR-21表达及自噬水平无明显改变(P＞0.05)；与mimicNC组相比，miR-21mimics组miR-21表达及自噬水平明显升高(P＜0.01;P＜0.05)；与inhibitorNC组相比，miR-21inhibitor组miR-21表达及自噬水平明显下降(P＜0.01;P＜0.05)；透射电镜结果显示，与N组对比，M组自噬体数量明显减少；与M组对比，HL组自噬体数量明显增多,与mimicsNC组相比，miR-21mimics组自噬体数量明显增多；与inhibitorNC相比，miR-21inhibitor组自噬体数量明显减少。与N组相比，M组MAPK/mTOR信号通路蛋白和mRNA的表达显著上调(P＜0.01)；与M组相比，HL组MAPK/mTOR信号通路蛋白和mRNA的表达显著下调(P＜0.01)；与HL组相比，mimicNC组和inhibitorNC组MAPK/mTOR信号通路蛋白和mRNA的表达水平无明显改变(P＞0.05)；与mimicNC组相比，miR-21mimics组MAPK/mTOR信号通路蛋白和mRNA表达明显降低(P＜0.01;P＜0.05)；与inhibitorNC组相比，miR-21inhibitor组MAPK/mTOR信号通路蛋白和mRNA表达明显升高(P＜0.01;P＜0.05)。
结论：
黄连解毒汤可能通过miR-21调节自噬通路MAPK/mTOR，从而提高自噬水平，改善AS
目的：
归纳AMI患者证素分布规律，着重研究热毒证素的分布特点，为更好地指导临床提供依据。
方法：
本部分研究采用回顾性分析方法，收集2016年1月——2019年1月期间因急性心肌梗死(AMI，Acute myocardial infarction)收住我院心内科患者的症状、体征及住院期间相关实验室检查等资料，建立数据库并对资料进行统计分析。在采集、整理资料之前，对参与人员进行统一培训，保证资料采集的一致性和可靠性。
结果：
1.本研究共纳入有效病例358例，其中ST段抬高型心肌梗死(STEMI)242例，占67.7%，非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)116例，占32.4%；男性患者282例，占78.8%，女性患者76例，占21.2%，且男性患者和女性患者在各年龄段分布有统计学差异(P＜0.01)；吸烟患者143例，占39.9%，饮酒患者18例，占5.0%，高血压患者202例，占56.4%，糖尿病患者116例，占32.4%，高总胆固醇患者125例，占34.9%，高甘油三酯患者100例，占27.9%，高低密度脂蛋白患者150例，占41.9%，且吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、高甘油三酯患者在各年龄段分布中存在统计学差异(P＜0.01;P＜0.05)，高胆固醇、高低密度脂蛋白患者在各年龄段分布中无统计学意义(P＞0.05)，吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、高胆固醇患者在男女中的分布存在统计学差异(P＜0.01;P＜0.05)；高甘油三酯、高低密度脂蛋白患者在男女中的分布无统计学意义(P＞0.05)。
2.本研究证素分布情况：病位证素中，心348例，占97.2%，肺81例，占22.6%，肝46例，占12.8%，脾44例，占12.3%，肾18例，占5.0%；病位证素组合中，心+肺76例，占21.2%，心+肝43例，占12.0%，心+脾41例，占11.5%，心+肾16例，占4.5%，肺+脾5例，占1.4%，肺+肾4例，占1.1%，心+肾+脾3例，占0.8%，心+脾+肺3例，占0.8%；病性证素中热毒194例，占54.2%，痰浊192例，占53.6%，血瘀154例，占43.0%，气虚71例，占19.8%，阴虚44例，占12.3%，气滞36例，占10.1%，阳虚18例，占5.0%，寒凝5例，占1.4%；病性证素组合中，热毒+痰浊97例，占27.1%，痰浊+血瘀67例，占18.7%，热毒+血瘀57例，占15.9%，痰浊+气虚33例，占9.2%，血瘀+气滞26例，占7.3%，血瘀+气虚21例，占5.9%，阴虚+痰浊20例，占5.6%，气虚+阴虚19例，占5.3%，热毒+血瘀+痰浊17例，占4.7%，热毒+阴虚16例，占4.5，痰浊+气滞11例，占3.1%，热毒+气虚11例，占3.1%。病位证素及病性证素进行聚类分析后呈现出以下证素组合规律：病位证素心、肺和病性证素热毒、痰浊、血瘀关联性大，病位证素脾和病性证素气虚、阴虚关联性大，病位证素肾和病性证素阳虚关联性大，病位证素肝和病性证素气滞关联性大。
3.本研究热毒证素分布规律：热毒证素与STEMI分布、吸烟、饮酒呈正相关，且有统计学意义(P＜0.01;P＜0.05)；热毒证素与年龄成负相关，且有统计学意义(P＜0.01)；热毒证素与性别因素无统计相关性(P＞0.05)；热毒证素与高甘油三酯呈正相关，且有统计学意义(P＜0.05)；热毒证素与高血压、糖尿病、高总胆固醇、高低密度脂蛋白等因素无统计相关性(P＞0.05)。热毒证素与病位证素心呈正相关，且有统计学意义(P＜0.05)；热毒证素与病位证素肝、脾、肾等呈负相关，且有统计学意义(P＜0.01)；热毒证素与病位证素肺呈正相关性，但无明显统计学差异(P＞0.05)；热毒证素与病性证素血瘀、寒凝、气滞、气虚、阴虚、阳虚呈负相关，且有统计学意义(P＜0.01;P＜0.05)；热毒证素与病性证素痰浊呈负相关，但无明显统计学差异(P＞0.05)。
结论：
AMI病位证素以心为主，病位证素组和以心+肺、心+肝、心+脾为主；病性证素中实证证素较多，虚性证素较少，实证证素中主要是热毒、血瘀、痰浊，其中热毒证素出现频率最高，虚性病素以气虚为主；病性证素组和以热毒+痰浊、痰浊+血瘀、热毒+血瘀为主，说明AMI病机虽为本虚标实，但以标实为主。热毒证素与STEMI、吸烟、饮酒、高甘油三酯、病位证素心呈正相关，与年龄因素呈负相关，发病患者越年轻，出现热毒证素机率越高，治疗上应重视清热解毒。
第二部分实验研究：基于miR-21介导自噬信号通路探讨清热解毒法干预AS的研究
目的：
从miR-21介导信号通路MAPK/mTOR调控自噬水平的角度，探讨清热解毒法干预动脉粥样硬化(AS)的细胞分子机制。
方法：
1.采用液相-质谱联用的方法对清热解毒代表方黄连解毒汤冻干粉进行定性、定量检测。
2.培养巨噬细胞系THP-1细胞，采用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导其成为泡沫细胞，观察其自噬水平、miR-21及MAPK/mTOR信号通路中相关分子的表达情况，以及黄连解毒汤的干预作用。在倒置显微镜下观察THP-1细胞形态；采用实时无标记细胞分析(RTCA)法检测THP-1细胞增殖情况，筛选ox-LDL及黄连解毒汤冻干粉(HL)溶液的最佳干预浓度及时间；通过油红O染色观察巨噬细胞泡沫样变水平，证实造模成功；采用透射电镜和蛋白质免疫印迹(Western blot，Wb)法检测正常组(N)、模型组(M)、HL组自噬小体和自噬蛋白LC3B、P62的表达差异；采用实时荧光定量PCR(qPCR)法观察miR-21的表达情况；采用Wb和qPCR法检测MAPK/mTOR信号通路蛋白和mRNA的表达情况。
3.将miR-21mimics/miR-21inhibitor转染至THP-1源性泡沫细胞，制备miR-21过表达/表达受抑的细胞模型，并用HL溶液对其进行干预。观察自噬蛋白LC3B、P62及MAPK/mTOR通路蛋白和mRNA的表达情况。检测方法同上。
结果：
1.定性检测出黄连解毒汤冻干粉含有巴马汀、杜仲醇、大黄酸、小檗碱等27种成分；定量检测其中七种成分含量为小檗碱0.55mg/g、黄连碱0.72mg/g、栀子苷5.02mg/g、黄柏碱0.46mg/g、表小檗碱2.98mg/g、巴马汀1.92mg/g、黄芩苷0.87mg/g。
2.RTCA实时检测表明ox-LDL浓度在160μg/ml及以下时细胞增殖不受影响，且40μg/ml浓度干预24h时观察自噬水平较正常组(N)出现明显下降，差异有统计学意义(P＜0.01;P＜0.05)；RTCA实时检测表明HL浓度在96μg/ml及以下时细胞增殖不受影响，用96μg/mlHL干预泡沫细胞观察不同时间点自噬水平变化，结果表明干预2h时自噬水平较模型组(M)明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)；分别用24μg/ml、48μg/ml、96μg/mlHL干预泡沫细胞2h，三个干预组较模型组(M)自噬水平均升高，且96μg/mlHL干预时自噬水平升高有统计学差异(P＜0.01;P＜0.05)；；细胞油红O染色表明，M组与N组相比脂质含量明显增多，HL组较M组明显减少;透射电镜检测自噬体表明，M组较N组相比自噬小体明显减少，HL组较M组相比自噬小体明显增多。
3.与N组相比，M组miR-21表达降低(P＜0.01)；与M组相比，HL组miR-21表达升高(P＜0.01)。与N组相比，M组MAPK/mTOR信号通路蛋白和mRNA的表达升高(P＜0.01;P＜0.05)；与M组相比，HL组MAPK/mTOR信号通路蛋白和mRNA的表达降低(P＜0.01;P＜0.05)。
4.与MAPK-WT+NC组相比，MAPK-WT+miR-21组荧光值明显下降(P＜0.01)；MAPK-MUT+NC组相比，MAPK-MUT+miR-21组荧光值无明显变化(P＞0.05)。与N组相比，M组miR-21水平及自噬水平明显降低(P＜0.01)；与miR-21mimics阴性对照(mimic NC)组相比，miR-21mimics组miR-21表达及自噬水平明显升高(P＜0.01;P＜0.05)；与miR-21inhibitor阴性对照(inhibitor NC)组相比，miR-21inhibitor组miR-21表达及自噬水平明显下降(P＜0.01;P＜0.05)；与N组相比，M组MAPK/mTOR信号通路蛋白水平明显上调(P＜0.01)；与mimicNC组相比，miR-21mimics组MAPK/mTOR信号通路蛋白表达明显降低(P＜0.01)；与inhibitorNC组相比，miR-21inhibitor组MAPK/mTOR信号通路蛋白表达明显升高(P＜0.01;P＜0.05)。
5.与N组相比，M组miR-21水平及自噬水平显著下降(P＜0.01;P＜0.05)；与M组对比，HL组miR-21水平及自噬水平显著上升(P＜0.01;P＜0.05)；与HL组相比，miR-21mimics阴性对照(mimic NC)组和miR-21inhibitor阴性对照(inhibitor NC)组miR-21表达及自噬水平无明显改变(P＞0.05)；与mimicNC组相比，miR-21mimics组miR-21表达及自噬水平明显升高(P＜0.01;P＜0.05)；与inhibitorNC组相比，miR-21inhibitor组miR-21表达及自噬水平明显下降(P＜0.01;P＜0.05)；透射电镜结果显示，与N组对比，M组自噬体数量明显减少；与M组对比，HL组自噬体数量明显增多,与mimicsNC组相比，miR-21mimics组自噬体数量明显增多；与inhibitorNC相比，miR-21inhibitor组自噬体数量明显减少。与N组相比，M组MAPK/mTOR信号通路蛋白和mRNA的表达显著上调(P＜0.01)；与M组相比，HL组MAPK/mTOR信号通路蛋白和mRNA的表达显著下调(P＜0.01)；与HL组相比，mimicNC组和inhibitorNC组MAPK/mTOR信号通路蛋白和mRNA的表达水平无明显改变(P＞0.05)；与mimicNC组相比，miR-21mimics组MAPK/mTOR信号通路蛋白和mRNA表达明显降低(P＜0.01;P＜0.05)；与inhibitorNC组相比，miR-21inhibitor组MAPK/mTOR信号通路蛋白和mRNA表达明显升高(P＜0.01;P＜0.05)。
结论：
黄连解毒汤可能通过miR-21调节自噬通路MAPK/mTOR，从而提高自噬水平，改善AS