【摘 要】
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精子在附睾转运的过程中,附睾上皮以及精子自身代谢会在附睾管腔微环境中产生一系列的活性氧（ROS）。适量的ROS可以参与调节精子的正常生理功能,而过量的ROS会导致精子发生氧化应激,因此附睾中ROS维持在正常的生理水平至关重要。附睾中存在不同形式的抗氧化酶,但这些酶是如何发挥作用的,目前仍未阐明。因此,本试验系统分析了绵羊附睾头、体、尾不同部位抗氧化酶的表达、活性和分布情况,为进一步阐明附睾抗氧化功
【基金项目】
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国家重点研发计划“绵羊新品种新品系培育及良繁--绵羊高效育种与繁殖关键技术研发”（2021YFD1300901）；
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精子在附睾转运的过程中,附睾上皮以及精子自身代谢会在附睾管腔微环境中产生一系列的活性氧（ROS）。适量的ROS可以参与调节精子的正常生理功能,而过量的ROS会导致精子发生氧化应激,因此附睾中ROS维持在正常的生理水平至关重要。附睾中存在不同形式的抗氧化酶,但这些酶是如何发挥作用的,目前仍未阐明。因此,本试验系统分析了绵羊附睾头、体、尾不同部位抗氧化酶的表达、活性和分布情况,为进一步阐明附睾抗氧化功能调控机制提供理论基础。1.不同部位附睾组织抗氧化酶的表达。采用q-PCR、以及Western Blot分别检测附睾头、体、尾组织中Cu,Zn-SOD、CAT、GPX5、以及PRDX6的表达情况。结果显示,Cu,Zn-SOD的mRNA和蛋白水平从附睾头到附睾尾的组织中呈升高趋势,附睾尾极显著高于附睾头和附睾体（P＜0.01）;CAT mRNA在附睾头组织中表达极显著高于附睾体和附睾尾（P＜0.01）,而其蛋白水平附睾体最高（P＜0.01）;GPX5、PRDX6的mRNA和蛋白在附睾组织从附睾头至尾均呈降低趋势,附睾头表达量最高,其表达量极显著高于附睾体和附睾尾（P＜0.01）。这说明在附睾组织不同部位对各种抗氧化酶的需求不同,因此其呈现区域差异性表达。2.不同部位附睾液抗氧化酶的表达。采用酶活性检测试剂盒检测不同部位附睾液总抗氧化力（TAC）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPXs）、以及过氧化物酶（PRDXs）的活性;并采用Western Blot试验分别检测附睾头、体、尾附睾液中Cu,Zn-SOD、CAT、GPX5、以及PRDX6的表达情况。结果显示,附睾尾的附睾液中TAC、GPXs活性、PRDXs活性均极显著高于附睾头和附睾体（P＜0.01）;SOD活性在附睾尾的附睾液中极显著高于附睾头（P＜0.01）,且显著高于附睾体（P＜0.05）;CAT活性在不同部位附睾液差异并不显著。Cu,Zn-SOD蛋白在附睾液中从附睾头至尾呈升高趋势,附睾尾部附睾液的表达量极显著高于附睾头和附睾体的附睾液（P＜0.01）。从附睾头至附睾尾的附睾液中CAT的蛋白水平先升高后降低,附睾体的附睾液中CAT蛋白表达量最高,极显著高于附睾尾附睾液（P＜0.01）,但附睾体的附睾液中CAT蛋白表达量显著高于附睾头附睾液（P＜0.05）。GPX5、PRDX6蛋白从附睾头至尾的附睾液呈降低趋势,附睾头中附睾液的表达量最高,其表达量极显著高于附睾体和附睾尾的附睾液（P＜0.01）。这说明在附睾组织为精子提供的管腔微环境中,与附睾头相比,附睾尾具备更高的TAC。附睾液中各抗氧化酶表达的变化趋势与附睾组织一致。3.不同部位附睾精子抗氧化酶的表达。采用酶活性检测试剂盒检测不同部位附睾精子TAC、SOD、CAT、GPXs、PRDXs的活性;然后采用Western Blot分别检测附睾头、附睾体、附睾尾精子中Cu,Zn-SOD、CAT、GPX5、以及PRDX6的蛋白表达;并采用免疫荧光检测抗氧化蛋白的分布情况。结果显示,附睾头至附睾尾的精子中TAC、GPXs活性、PRDXs活性均呈升高趋势,附睾尾精子极显著高于附睾头和附睾体的精子（P＜0.01）;相反,SOD活性呈降低趋势,附睾头精子显著高于附睾体精子（P＜0.05）;而CAT活性在附睾精子中并未检测到。从附睾头至尾的精子中Cu,Zn-SOD蛋白表达均呈升高趋势,附睾尾精子的表达量极显著高于附睾头精子和附睾体精子（P＜0.01）,另外,对于不同部位附睾精子,在整个精子上均有Cu,Zn-SOD阳性信号分布。GPX5蛋白表达从附睾头至附睾尾精子中均呈降低趋势,附睾头中精子的表达量最高,其表达量极显著高于附睾体精子和附睾尾精子（P＜0.01）;免疫荧光结果显示,GPX5在附睾中精子的核后帽、颈部、以及精子尾部中段和主段强烈表达,尾部末端轻微表达;PRDX6蛋白表达从附睾头到附睾尾的精子中呈下降趋势,附睾头精子PRDX6蛋白表达量极显著高于附睾体精子和附睾尾精子（P＜0.01）,而附睾体精子又极显著地高于附睾尾精子（P＜0.01）。PRDX6的免疫荧光结果表明,附睾头部的精子PRDX6仅在精子头部强烈表达,尾部不表达;随着精子进入附睾体和附睾尾,PRDX6在精子的头部、尾部中段和主段均有表达,尾部末端不表达。此外,无论是Western blot还是免疫荧光检测,在不同部位附睾精子上都并未检测到CAT蛋白的表达。总之,以上结果表明,Cu,Zn-SOD、GPX5、以及PRDX6在附睾组织、附睾液、以及附睾精子的变化趋势具有相似性,但是CAT的抗氧化功能并不是必需的。附睾尾具备更高的抗氧化酶活性,需要更复杂的抗氧化体系保护其中的精子免受氧化损伤。
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