【摘 要】
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研究背景色氨酸羟化酶2(TPH2)作为神经元五羟色胺(5-HT)合成的限速酶,控制中枢五羟色胺(5-HT)的合成。5-HT可以与下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)以及交感神经系统共同作用参与应
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研究背景色氨酸羟化酶2(TPH2)作为神经元五羟色胺(5-HT)合成的限速酶,控制中枢五羟色胺(5-HT)的合成。5-HT可以与下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)以及交感神经系统共同作用参与应激调节。应激往往会导致一些常见的心理疾病比如焦虑症、抑郁症等,因此应激成为情感障碍发病机制研究的关键性问题。科学家利用Tph2基因敲除小鼠为模型,对各种行为疾病如焦虑、抑郁、阿尔兹海默等病理机制以及母性行为的研究取得了很大进展。但是小鼠与人类在生理特性和组织结构上存在较大差异,所以建立大动物模型进一步进行疾病相关研究是有价值的。小型猪在解剖学和生理上和人类近似,适合用于建立大动物疾病模型,但Tph2基因敲除猪还没有被报道。为此,本项目以巴马小型猪胎儿成纤维细胞为材料,通过CRISPR/Cas9技术制备Tph2基因敲除(Tph2-/-)细胞系,再通过体细胞核移植,构建了Tph2基因敲除猪。HE染色结果显示Tph2-/-猪的5-HT神经元未发生明显结构变化,免疫组化以及western实验显示Tph2-/-猪脑干中无TPH2蛋白表达,敲除克隆猪的体重和生存情况要弱于野生巴马猪。Tph2基因敲除猪模型的建立将深入开展5-HT相关行为学的研究,并进一步揭示5-HT相关疾病的发病机制。研究目的通过敲除巴马小型猪的Tph2基因,培育国际上首批Tph2-/-巴马小型猪模型,作为研究5-HT相关行为疾病机理,药物测试及预防治疗的大动物模型。研究方法利用网络在线工具(http://crispr.mit.edu/)设计sgRNA作为Tph2基因敲除的引导序列,与pX330质粒重组构建CRISPR/Cas9打靶载体;重新构建的CRISPR/Cas9打靶载体与含有G418抗性基因的tdTomato质粒载体共同转染巴马猪胎儿成纤维细胞(PFFs),抗性培养基筛选挑取单克隆后,通过基因组PCR鉴定方式获得Tph2等位基因双敲除的细胞克隆;以获得的Tph2等位基因双敲除的细胞克隆作为体细胞核移植(SCNT)供体,通过SCNT技术,构建世界上首例Tph2等位基因双敲除巴马猪模型。新生克隆小猪出生48小时之后,剪取耳部组织,提取基因组DNA,经过PCR测序鉴定Tph2基因敲除情况。并且记录小猪体重和生存指标,HE,免疫组化,western实验分析TPH2蛋白表达情况,免疫组化分析5-HT合成情况。实验结果利用网络在线工具(http://crispr.mit.edu/)设计两段sgRNA(sgRNA1和sgRNA2),并且成功构建CRISPR/Cas9打靶载体,最后通过验证打靶效率选取sgRNA 1作为引导序列的CRISPR/Cas9打靶载体转染PFFs,通过G418药物筛选得到等位基因单敲除的巴马猪细胞克隆数为12个,等位基因双敲除的巴马猪细胞克隆数为20个。将CRISPR/Cas9技术筛选获得的等位基因双突变细胞作为核移植供体,通过SCNT技术,成功获得11头Tph2敲除巴马猪。Western和免疫组化结果显示TPH2蛋白在脑干区域无合成,5-HT免疫组化结果显示脑干5-HT合成受阻。结论使用CRISPR/Cas9技术,与SCNT技术相结合,进一步成功构建正常生长的Tph2纯合子敲除巴马猪模型。我们的结果不仅显示CRISPR/Cas9技术是构建基因改造猪的高效工具,也证明Tph2敲除猪是适合研究5-HT生理功能的大动物模型。
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