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目的：建立大鼠慢性咽炎动物模型,探讨咽部受炎症刺激后对颈椎间盘组织中炎性介质和细胞因子含量和表达的影响,阐述颈椎间盘退变过程的炎性反应机制。在此基础上,给予益气和营清咽方和麝香酮进行治疗,观察中药复方及单体抑制慢性咽炎和延缓椎间盘退变的作用机制,为颈椎间盘退变性疾病的临床研究和指导用药提供实验依据。在中医药理论上,深化喉痹与颈椎病痹证理论的认识,为颈椎病从痹论治提供理论依据。
方法：在建立大鼠慢性咽炎动物模型的基础上,分别采用同位素示踪技术、组织病理学、免疫组织化学、ELISA、Real-time PCR等方法和技术,研究颈椎间盘对炎症因子PGE2的浓集量,观察咽粘膜组织形态、颈椎间盘组织局部炎症介质和细胞因子的变化。并在此研究方法和动物模型的基础上,进一步研究益气和营清咽方和麝香酮的药效机制。
结果：
1.3H-PGE2同位素示踪实验。颈不同节段椎间盘组织放射性比活度普遍高于胸5-6、腰3-4椎间盘,颈椎下段明显高于上段,即3H-PGE2在颈椎下段的浓集量明显高于上段。与腰3-4椎间盘相比,对照组颈2-3椎间盘、颈6-7椎间盘和模型组颈5-6椎间盘放射性比活度结果有统计学意义(p<0.05)。与正常对照组相比,模型组不同节段椎间盘放射性比活度普遍高于对照组相应椎间盘。
2.关于慢性咽炎动物模型的建立及咽粘膜形态学观察。
①症状体征观察：从动物模型建立第2天开始,大部分模型组大鼠逐渐出现搔抓口部,口腔分泌物增多,精神疲乏,自发活动减少,咽部充血呈暗红色、微肿胀等症状与体征,动物模型建立后第5天症状较明显。对照组则未出现上述情况。各用药组大鼠在用药3天后以上症状逐渐减轻,咽部分泌物减少,但充血仍然较明显。
②咽粘膜病理形态学观察：模型组大鼠咽部粘膜上皮(钉突状)增生,固有层和粘膜下层淋巴细胞有不同程度增生,血管数量显著增多,粘膜下层内粘液腺分泌活跃。各用药组大鼠咽粘膜层均还存在一定病变,但无论从程度还是受累动物数量上来说都明显轻于模型组。咽部组织上皮增生较轻,固有层内充血轻,血管数量较少,炎细胞浸润以轻度为主,少数动物固有层内有纤维增生现象。
3.检测颈椎间盘组织中炎症介质PLA2、PGE2含量。采取ELISA法。慢性咽炎在一定程度上增加大鼠颈椎间盘组织中PLA2、PGE2含量,与正常对照组相比,模型组PLA2、PGE2含量升高最明显,有统计学意义(p<0.01);与模型组相比,各用药组PLA2、PGE2含量下降,麝香酮组、莫比可组PLA2含量下降明显,有统计学意义(p<0.01)。
4.检测颈椎间盘组织中IL-1 α、TNFα蛋白表达。采用免疫组织化学法。
①各组免疫组化染色结果：各组颈椎间盘组织TNFα、IL-1α阳性在软骨终板的表达多集中在钙化层,非钙化层阳性表达相对较少,在纤维环的表达多集中在外缘,在髓核的表达多呈中心性分布。与对照组相比,模型组无论在软骨终板、纤维环还是在髓核的表达都明显增强,在纤维环外缘和在软骨终板钙化层与非钙化层之间出现强阳性表达,各用药组TNFα、IL-1α阳性表达在椎间盘的各个部分都有不同程度改善,阳性表达较模型组减少。
②各组免疫组化染色积分光密度值统计结果：与正常对照组相比,模型组TNFα、IL-1α在椎间盘各个部位的表达都不同程度增强,尤其在软骨终板和纤维环的表达最明显,有统计学意义(p<0.05或p<0.01);与模型组相比,各药物组TNFα、IL-α在椎间盘各个部位的表达都有不同程度下降,在软骨终板的表达下降最明显,有统计学意义(p<0.01)。
5.检测颈椎间盘组织中IL-1α、TNFα基因表达。采用Real-time PCR法。与正常对照组相比,模型组IL-1α、TNFα mRNA的表达显著增高,有统计学意义(p<0.01);与模型组相比,益气和营清咽方组、麝香酮组、莫比可组IL-1α、TNFα mRNA的表达不同程度下调,有统计学意义(p<0.05或p<0.01)。
结论：从3H-PGE2同位素示踪实验研究得出,咽部长期的炎症刺激使颈椎间盘组织中炎症因子的浓集量增高。从症状体征、组织病理学等方面证明大鼠慢性咽炎动物模型的建立。从免疫组织化学、ELISA、Real-time PCR等方面证明了慢性咽炎诱导或加剧颈椎间盘组织的炎性反应,益气和营清咽方和麝香酮不同程度抑制咽与颈椎间盘组织的炎性反应。
阐述了中医药学有关喉痹和颈项痹发病的相关性,深化了颈椎病痹证理论的研究。从整体观念和辩证论治出发,益气和营清咽法体现了异病同治的科学性。