论文部分内容阅读
研究背景从中医理论解释“实热上火”属于热证范畴,认为是人体阴阳平衡失调的结果,感受外邪或人体机能活动亢进,会产生阳盛阴衰的热证证候。本课题内容是国家重点基础研究发展计划973项目-“上火”的机理与防治研究的延续,其初步对“上火”提出了现代医学概念,即“上火”可能是因精神紧张、过度劳累、热量摄入过多、菌群失调以及人体易感体质等因素作用下,导致以氧化应激、能量代谢、炎症免疫为主的内环境紊乱,出现以头面部皮肤黏膜损伤为主要表现,并可伴有全身症状的一种轻微且易反复的疾病。可见此过程与炎症、氧化应激发生、能量代谢紊乱以及脂质代谢失常密切相关。在此基础上本课题组进行清热泻火方药黄连解毒汤干预“实热上火”的作用机制研究。课题组前期通过黄连解毒汤化学成分及质量控制研究及其干预“实热上火”动物模型的作用机制、体内外代谢、药动-药效关联性研究等,明确了此方剂的有效成分、体内过程、作用效果。以此为基础,开发其为浓缩水蜜丸并申报新药黄连解毒丸。“黄连解毒丸”为国内首个获批临床研究的中药证候类新药,继承和发扬了中医药诊疗特色和优势,完善了符合中药特点的技术评价体系,但中医证候的模糊性与方剂的复杂性及四诊信息的主观和经验性,使证候的认定缺乏客观性和公认性。中医证候诊治的科学性应从患者的主观感受向客观数据过度,证候临床生物标志物是证候类中药新药临床疗效评估的客观指标。本研究以实热火毒证为模式证候,以黄连解毒丸为试药,围绕引起实热火毒证的密切相关因素“炎症-能量代谢-氧化应激”,开展临床干预试验,采用非靶向代谢组学、靶向脂质组学、超敏多因子电化学发光、液相悬浮芯片、酶联免疫等整合技术,构建各影响因素间关联性网络分析,全面分析黄连解毒丸对实热火毒证受试者临床样本差异变量的影响,发现并辨识确证临床可检测的实热火毒证生物标志物,旨在寻找黄连解毒丸用于诊断实热火毒证的有效性生物标志物。目的1为厘清黄连解毒丸化学模式,明确其物质基础及为临床提供药物的稳定性,本研究从中药分析角度出发,利用现代中药分析技术,对黄连解毒丸进行化学成分定性分析,及对筛选出的9种含量较高的主要活性成分进行定量研究。2为探索和筛选黄连解毒丸用于诊断实热火毒证的有效性临床生物标志物,本研究应用非靶向代谢组学及靶向脂质组学技术对正常组、实热火毒证组、黄连解毒丸组受试者的血浆样品进行轮廓分析;围绕引起实热火毒证的密切相关因素“炎症-能量代谢-氧化应激”,对受试者的血浆进行生化指标检测;基于以上研究筛选得到的潜在生物标志物进行网络相关性分析,进行小样本量黄连解毒丸干预实热火毒证生物标志物发现研究。3基于黄连解毒丸干预实热火毒证生物标志物的发现研究结果,验证潜在生物标志物的准确性,并根据结果指示,围绕ATP和三羧酸循环进行扩展研究。4基于大样本量的Ⅱ期临床随机、双盲、多中心、安慰剂组对照试验设计方法,进行黄连解毒丸干预实热火毒证血浆和唾液中临床生物标志物探索与筛选研究,初步阐明黄连解毒丸治疗实热火毒证的作用机制。方法1应用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS液质联用技术对黄连解毒丸中化学成分进行分析,鉴定黄连解毒丸中化学成分;应用高效液相色谱法建立同时测定黄连解毒丸中9种主要活性成分(京尼平龙胆双糖苷、盐酸黄连碱、表小檗碱、小檗碱、巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、栀子苷)含量的方法。2根据实热火毒证候纳入和排出标准,筛选受试者57例作为实热火毒证组,这57例患者给予干预药物黄连解毒丸后作为黄连解毒丸组,同时招募20位健康志愿者作为对照组分别采集血液样品,进行黄连解毒丸干预实热火毒证临床生物标志物发现研究;应用液质联用技术进行血浆非靶向代谢组学及靶向脂质组学研究,所得数据进行主成分分析与正交偏最小二乘法-判别分析,筛选VIP>1,T检验(P<0.05)的差异代谢物;采用液相悬浮芯片技术对血浆中10种炎症因子(IL-1beta,IL-4,IL-6,IL-8,IL-10,IL-12p70,IL-13,TNF-alpha,MCP-1,MIP-1alpha)进行含量测定;采用试剂盒对8种能量代谢因子(柠檬酸,琥珀酸,糖皮质激素,三磷酸腺苷,乳酸脱氢酶,乳酸,丙酮酸,促甲状腺激素)和3种氧化应激因子(细胞外超氧化物歧化酶,4-羟基壬烯醛,促肾上腺皮质激素)进行含量测定;通过Cytoscape v3.4.0和MetaboAnalyst软件从代谢物-代谢物相互作用网络分析、蛋白质-酶/转运体-代谢物网络分析、KEGG通路富集分析三个角度探索差异表达的潜在生物标志物之间的关联。3 选取与黄连解毒丸干预实热火毒证生物标志物发现研究同期入组的另外30例受试者,验证此前发现研究中得到的潜在生物标志物的准确性,并根据结果指示,建立基于液质联用技术的三羧酸循环中间代谢物含量测定方法,测定血浆中三羧酸循环中间代谢物(富马酸,顺式乌头酸,柠檬酸,乳酸,苹果酸,琥珀酸,α-酮戊二酸,色氨酸,甘氨酸,丝氨酸,谷氨酰胺,谷氨酸,丙氨酸,一磷酸腺苷,葡萄糖,丙酮酸)的含量。4选取天津中医药大学第二附属医院、黑龙江中医药大学附属医院、成都中医药大学附属医院、湖南中医药大学第一附属医院以及辽宁中医药大学附属医院开展Ⅱ期临床研究,采用随机、双盲、多中心、安慰剂组对照临床试验设计,入组实热火毒证受试者,随机分为安慰剂组和黄连解毒丸组,分别收集给药前与给药后的血浆、唾液样品。采集到黄连解毒丸组与安慰剂组给药前后各116例,113例生物样品;采用超敏电化学发光检测技术测定唾液与血浆中10种炎症因子(IFN-y、IL-10,IL-12p70,IL-13,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-6,IL-8,TNF-α)的含量变化;应用液质联用技术测定血浆与唾液中三羧酸循环中间代谢物的含量变化;采用酶联免疫检测法对血浆中三磷酸腺苷、4-羟基壬烯醛与促肾上腺皮质激素进行含量测定,所有数据采用成对T检验,Wilcoxon秩和分析。结果1 通过液质联用技术对黄连解毒丸进行化学成分分析,共鉴定出化合物84种,主要包含生物碱、黄酮和环烯醚萜三类化合物。建立了同时测定黄连解毒丸中9种主要活性成分含量的方法,并进行了方法学考察(线性回归、精密度、重复性、稳定性、回收率、含量测定),结果良好。2 对受试者血浆进行非靶向代谢组学研究,通过数据分析,结果显示健康对照组与实热火毒证组之间鉴定出17个组间潜在证候生物标志物,实热火毒证组与黄连解毒丸组之间鉴定出13个组间潜在功效生物标志物,三组共有且给黄连解毒丸后有显著改善作用的差异代谢物有7种。其中实热火毒证组降低,黄连解毒丸干预后升高的是L-赖氨酸,双氢鞘氨醇和密环菌癸素;实热火毒证组升高,黄连解毒丸干预后降低的是左旋肉碱,L-组氨酸,精胺和焦谷氨酰甘氨酸。将7个通过模式识别筛选出的潜在生物标志物导入MetaboAnalyst软件进行代谢通路分析可知黄连解毒丸治疗实热火毒证主要对机体的组氨酸代谢,β-丙氨酸代谢,鞘脂代谢等代谢通路产生影响。对受试者血浆进行靶向脂质组学研究,结果显示健康对照组和实热火毒证组有46个潜在脂质类证候生物标志物,实热火毒证组与黄连解毒丸组有26个潜在脂质类功效生物标志物,三组血浆共有且给黄连解毒丸后有显著改善作用的差异脂质有22个,其中实热火毒证组降低,给药干预后升高的有 19 个,分别为 LPC14:0,LPC15:0-1,LPC16:0,LPC 16:1,LPC17:0,LPC17:1,LPC18:0,LPC18:1,LPC19:0,LPC20:1,LPC20:2,LPC20:4,LPE16:0,LPE18:0,LPE18:1,LPE18:2,PC39:4-1,PE36:4 和 SM42:4;实热火毒证组升高,给药干预后降低的有3个,分别为PC34:2,PC36:2-2和PC42:5-2。通过计算ROC曲线下面积(AUC),评估健康对照组和实热火毒证组之间以及实热火毒证组和黄连解毒丸干预组之间上述22种差异脂质的诊断能力,有13种脂质(LPC15:0-1,LPC16:0,LPC16:1,LPC17:0,LPC17:1,LPC18:0,LPC19:0,LPC20:1,LPC20:4,LPE16:0,LPE18:1,PC34:2,SM42:4)有诊断效力(AUC>0.7)。检测黄连解毒丸治疗前后血浆中炎症因子、氧化应激因子、能量代谢因子相关生化指标的变化,结果表明黄连解毒丸显著降低SA(P<0.001);TNF-α,ATP,CA(P<0.01),IL-8,4-HNE,PA,LDH(P<0.05)的水平。黄连解毒丸干预后GC,ACTH(P<0.01);LA,IL-4,IL-10(P<0.05)的含量显著升高。将多种影响因素(炎症因子、氧化应激和能量代谢因子)和多组学研究(靶向和非靶向分析)得到的潜在生物标志物进行网络关联分析,从KEGG通路富集分析可知差异表达的潜在生物标志物与TCA循环;丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢;丙酮酸代谢;和β-丙氨酸代谢通路密切相关。从代谢物-代谢物相互作用网络分析来看,ATP是关键点。通过蛋白质-酶/转运蛋白-代谢物网络分析可知差异脂质和代谢物与一些炎症因子相关,如IL-10,IL-4和TNF-α。TNF-α主要通过PLA2G4A影响差异脂质。此外,观察到ATP可能与IL-10,TNF-α和IL-4相互作用。ATP可能调节一些差异代谢物及能量代谢因子,如CA,SA,PA,L-组氨酸,L-赖氨酸。由此部分结果可知黄连解毒丸对实热火毒证的治疗作用机制主要涉及对ATP和TCA循环的调节。3选取与黄连解毒丸干预实热火毒证生物标志物发现研究同期入组的另外30例受试者,进行小样本验证试验,并纳入30例健康志愿者作为对照组开展验证及拓展研究。结果显示实热火毒证组与健康正常组相比,血浆中TNF-a,IL-10,IL-4,IFN-γ,IL-6,IL-12p70,IL-1β,AMP,顺式乌头酸,柠檬酸,丙酮酸(P<0.0001);α-酮戊二酸(P<0.001);IL-8,IL-13,SA,苹果酸(P<0.01);乳酸(P<0.05)显著升高;ACTH,MCP-1,GC,TSH,甘氨酸,丝氨酸,谷氨酰胺,色氨酸(P<0.0001);4-HNE(P<0.01);葡萄糖,丙氨酸(P<0.05)显著降低。黄连解毒丸组与实热火毒证组相比,LDH显著上升(P<0.001);GC,4-HNE(P<0.0001);IFN-γ,AMP,富马酸(P<0.01);TNF-a,IL-4,IL-8,IL-6,IL-12p70,TSH,SA,乳酸,谷氨酸(P<0.05)显著下降。4大样本量Ⅱ期临床研究中患者干预前后血浆测定结果:黄连解毒丸组与安慰剂组给药前后IL-2组间比较P=0.064,有差异趋势,但无统计学意义,黄连解毒丸组干预后IL-2呈显著性下降(P<0.01);IL-4,IL-10在黄连解毒丸组与安慰剂组给药前后组间比较差异无统计学意义,但黄连解毒丸组给药后IL-4显著上升(P<0.001)。黄连解毒丸组与安慰剂组给药前后组间比较α-酮戊二酸(P<0.01);4-HNE,顺式乌头酸(P<0.05)有统计学意义,4-HNE在黄连解毒丸组给药后显著下降(P<0.05),安慰剂组给药后为上升趋势。IL-6,柠檬酸在黄连解毒丸组与安慰剂组给药前后组间比较P值分别为0.063,0.053,有差异趋势;ATP,ACTH分析结果显示给药后黄连解毒丸组与安慰剂组均显著下降(P<0.05)。Ⅱ期临床患者干预前后唾液中测定结果:IL-10在黄连解毒丸组和安慰剂组给药前后组间比较有统计学意义(P<0.05),黄连解毒丸组IL-10给药后有上升趋势与前期实验结果趋势一致,但差异无统计学意义,安慰剂组给药后显著下降(P<0.01);IL-6分析结果显示黄连解毒丸组和安慰剂组给药前后组间比较P=0.095,有差异趋势;IL-2,SA,谷氨酸,谷氨酰胺,丙氨酸,色氨酸,甘氨酸在黄连解毒丸组与安慰剂组给药前后组间比较虽无统计学意义,但IL-2在黄连解毒丸组和安慰剂组给药后均显著下降(P<0.0001,P<0.01);黄连解毒丸组给药后SA(P<0.05),谷氨酰胺(P<0.001)显著下降,谷氨酸,丙氨酸有下降趋势(P=0.053,P=0.077);黄连解毒丸组与安慰剂组给药后色氨酸(P<0.001,P<0.05);甘氨酸(P<0.05;P<0.01)均显著下降。结论本研究通过对黄连解毒丸进行化学成分定性定量研究,较为全面地阐明了黄连解毒丸的物质基础,并为临床提供了药物的稳定性。在黄连解毒丸干预实热火毒证的临床生物标志物发现研究中,发现黄连解毒丸能够显著调节炎症因子(TNF-α,IL-10,IL-8和IL-4)、氧化应激因子(4-HNE和ACTH)、能量代谢因子(CA,SA,GC,ATP,LDH,PA和LA)以及差异脂质和代谢物。将这些差异表达的物质通过网络相关性分析,发现其与ATP和TCA循环密切相关。通过验证及拓展研究,确证黄连解毒丸能够显著调节TNF-a,IL-8,4-HNE,SA。通过Ⅱ期临床随机、双盲、多中心、安慰剂组对照大样本量探索与筛选研究,发现血浆中IL-2,IL-4,4-HNE,ATP,α-酮戊二酸,顺式乌头酸以及唾液中IL-10,IL-2,SA,谷氨酰胺,色氨酸与黄连解毒丸治疗实热火毒证作用机制显著相关。本论文中4-HNE,SA两个指标在三次黄连解毒丸治疗实热火毒证临床生物标志物研究中均表现显著;TNF-a,IL-4,IL-8,IL-10,ATP在其中两次临床研究中均表现显著,这些指标后续会在Ⅲ期临床中进一步验证。通过二期临床大样本量筛选,IL-2,α-酮戊二酸,顺式乌头酸,谷氨酰胺,色氨酸的显著性也显现出来,后续研究将重点关注。本研究结果初步阐明了黄连解毒丸治疗实热火毒证的作用机制,可作为深入探索黄连解毒丸治疗实热火毒证临床生物标志物的研究依据,并为Ⅲ期临床研究黄连解毒丸治疗实热火毒证候临床生物标志物指明方向。