论文部分内容阅读
目的:探讨MMPs通路相关蛋白MMP-2(matrix metalloproteinases-2)、MMP-14(matrix metalloproteinases-14)及TIMP-1(tissue inhibitor of matrix-1)、TIMP-2(tissue inhibitor of matrix-2)、AGEs-RAGE蛋白在糖尿病大鼠心肌纤维化过程中的变化,同时观察厄贝沙坦干预后对糖尿病大鼠心肌纤维化的影响及MMPs通路及AGEs-RAGE蛋白的变化。方法:1.糖尿病大鼠模型的制备与分组健康雄性SD大鼠随机分成三组:正常对照组(CON)、高糖高脂组(HC)和糖尿病实验组。正常对照组(CON)大鼠常规饮食,其余组大鼠给予高糖高脂饮食,4周后实验组大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)30 mg/kg,建立2型糖尿病模型。剔除不合格大鼠后将成功模型随机分为糖尿病组(DM)、厄贝沙坦+糖尿病组(Ir+DM)。Ir+DM组大鼠给予厄贝沙坦(50 mg/kg/d)连续灌胃至4w、8w、12w。2.观察大鼠的一般情况(包括精神状况、饮食、反应、毛发等)。3.每周测量大鼠体重(body weight,BW),以便调节厄贝沙坦用药量。4.不同时段测定空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)水平,观察模型维持情况。5.分别在4w、8w、12w处死各亚组,计算各组大鼠心体比(heart weight/body weight,H/B)和左室重量指数(left ventricular weight index,LVWI)。留取动脉血测定各组大鼠血浆甘油三酯(triglyceride,TG)及胆固醇(total cholesterol,TC)水平。6.HE、Masson染色观察心肌胶原形态。观察糖尿病大鼠心肌纤维化的病理形态变化。7.ELISA法检测心脏组织I型胶原(Collage type I,col I)、III型胶原(Collage type III,col III)含量,血浆TIMP-1、TIMP-2含量。8.Western blotting检测心脏组织AGE、RAGE、col I、MMP-2、TIMP-2、MMP-14蛋白表达量。结果:1.大鼠的一般情况模型组大鼠均出现明显的多食、多饮及体重减轻等糖尿病典型症状,体毛凌乱且无光泽,反应迟钝并且有大鼠出现白内障及坏疽等症状。治疗组一般状态均较模型组有所好转。厄贝沙坦给药后可以改善糖尿病的一般状况。2.各组大鼠体重(BW)、空腹血糖(FBG)、心体比(H/B)、左室重量指数(LVWI)、甘油三酯(TC)、总胆固醇(TG)变化情况与CON 4w组相比,HC 4w组BW显著增加(P<0.01),FBG、H/B、LVWI无明显变化;与CON 4w组及HC 4w组相比,DM 4w组大鼠BW、H/B、LVWI无明显变化,FBG显著升高(P<0.01);与DM 4w组相比,Ir+DM 4w组的BW、H/B、LVWI、FBG无明显变化。与CON 8w组相比,HC 8w组BW显著增加(P<0.01),FBG、H/B、LVWI无明显变化;与CON 8w组及HC 8w组相比,DM 8w组大鼠BW显著减轻(P<0.01),FBG、H/B、LVWI显著增加(P<0.01);与DM 8w组相比,Ir+DM 8w组的BW明显升高,H/B、LVWI明显降低(P<0.01),FBG无明显变化。12w时变化趋势同8w。与CON组比较,HC组、DM组及Ir+DM组大鼠血浆TG、TC含量均显著增高(P<0.01);与DM组相比,厄贝沙坦治疗后两者含量变化不明显。3.各组大鼠的心脏病理学变化HE染色结果显示,DM组心肌纤维排列不整齐,纤维断裂,细胞间隙增宽。Ir+DM组病理情况有所改善。Masson染色结果显示,DM组大鼠心脏间质可见大量的胶原纤维异常增生,胶原堆积,或交织呈网状,分布不均,纤维化程度较高;Ir+DM组间质见少量胶原纤维增生,纤维化程度较DM组降低。4.ELISA检测各组大鼠心脏组织col I、col III、血浆TIMP-1、TIMP-2含量变化4w时,各组大鼠心肌组织col I、col III含量及col I/col III比值变化不明显,差异无统计学意义(P﹥0.05)。与CON 8w组相比,HC 8w组心肌组织中col I、col III含量、col I/col III比值、血浆TIMP-1、TIMP-2含量变化不明显;与CON8w组及HC 8w组相比,DM 8w组心肌组织中col I、col III含量及col I/col III比值,血浆TIMP-1、TIMP-2含量显著增加(P<0.01);与DM 8w组相比,Ir+DM8w组四者含量均显著降低(P<0.01),且随病程延长变化趋势越明显。5.Western blotting检测心肌组织col I、AGE、RAGE、MMP-2、TIMP-2、MMP-14蛋白表达量与CON组相比,HC组各时间段心肌组织中col I蛋白的表达水平无明显变化;与CON、HC组同时间段相比,DM 4w心肌组织中col I蛋白的表达水平变化不明显,DM 8w大鼠col I蛋白表达水平显著增加(P<0.01),且随着病程的延长呈增高趋势;厄贝沙坦治疗后,col I蛋白表达水平显著下降(P<0.01)。与CON组相比,HC 12w组心肌组织中AGE、RAGE、MMP-2、TIMP-2、MMP-14蛋白的表达水平变化不明显;与HC 12w组相比,DM 12w组大鼠心肌组织AGE、RAGE、TIMP-2、MMP-14蛋白表达水平显著增加(P<0.01),MMP-2蛋白表达水平及MMP-2/TIMP-2比值显著下降(P<0.01);给予厄贝沙坦治疗后,与DM 12w组相比,AGE、RAGE、TIMP-2、MMP-14蛋白表达水平显著下降(P<0.01),MMP-2蛋白表达水平及MMP-2/TIMP-2比值显著增加(P<0.01)。结论:1.2型糖尿病大鼠心肌纤维化模型复制成功。2.糖尿病大鼠心肌组织中,随病程延长(1)AGE、RAGE、col I蛋白表达上调,提示胶原纤维合成增加;(2)MMP-2蛋白表达下调,TIMP-2蛋白表达上调及MMP-2/TIMP-2比值下调提示胶原纤维分解减少;(3)MMP-14蛋白表达增加提示MMP-14参与纤维细胞的分化,诱导心室重构;血浆TIMP-1、TIMP-2水平增加提示左室功能障碍及纤维化加重。3.厄贝沙坦具有改善糖尿病大鼠心肌纤维化的作用,其机制可能为:(1)下调AGEs、RAGE蛋白表达,减少胶原合成;(2)上调MMP-2蛋白表达,下调TIMP-2蛋白表达,升高MMP-2/TIMP-2比值,影响胶原代谢,促进胶原降解。