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目的T细胞免疫应答失调是再生障碍性贫血的关键病理机制,抑制T细胞异常激活是重要治疗措施。有研究显示中医脏腑病变会影响机体的免疫调节,脾虚与肾虚是再生障碍性贫血常见证候要素,两者对于免疫功能的影响是否有异目前尚无相关研究。通过中医药健脾补肾治疗再障常有一定疗效,提示健脾补肾法可能有助于调控免疫功能。本课题以脾虚血亏和肾虚血亏证的慢性再生障碍性贫血患者为研究对象,探讨中医证候分型与T细胞免疫应答失调的相关性,明确脾虚及肾虚对T细胞亚群失调程度的不同影响,以健脾补肾中药为干预措施,初步探索依据脾虚血亏及肾虚血亏为主要分型应用中医药调控T细胞免疫应答治疗再生障碍性贫血的作用机制。方法1.回顾性研究慢性再生障碍性贫血脾虚血亏证与肾虚血亏证患者T细胞免疫应答的差异,明确T细胞免疫应答失调与中医证型分布的相关性。收集经临床表现、实验室检查诊断为慢性再生障碍性贫血(Chronic aplastic anemia,CAA,简称慢性再障)的住院患者,纳入标准:①确诊为慢性再障;②2011年1月至2018年5月在北京中医药大学东直门医院血液肿瘤科住院治疗;③中医证候分型为脾虚血亏证或肾虚血亏证;④应用流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群;⑤住院期间合并发热、感染性疾病、肿瘤性疾病者除外。参照《中医虚证诊断标准》与《中药新药临床研究指导原则》结合行业专家组意见拟定脾虚血亏证及肾虚血亏证诊断标准,在住院病历中提取中医四诊信息进行证候再分型。与健康成年人对照,明确再障患者T淋巴亚群(CD4+、CD8+、Treg及CD4+/CD8+比值)失调情况;分析脾虚血亏证与肾虚血亏证患者细胞毒性T细胞异常激活程度的差异,通过单因素相关分析,探讨年龄、性别、病程、全血细胞分析、T淋巴细胞亚群与中医证候分型的相关性,进一步采用二元Logistic回归法分析独立影响因素。收集可评价临床疗效的病例,分析证候分型与T细胞免疫应答、临床疗效的相关性。2.进一步探索不同证型应用中医药调控T细胞免疫应答治疗再障的作用机制。拟于2018年8月至2019年11月纳入肾虚血亏证或脾虚血亏证的慢性再障20例,以健脾补肾中药为干预措施,酌情联合西医基础治疗,1疗程为3个月,连续应用2个疗程,共6个月。入组时、治疗3个月、治疗6个月时进行中医证候评分。入组时及治疗后每月检测1次全血细胞分析;入组时及治疗6个月流式细胞仪检测外周血T细胞CD4+、CD8+、CD4+/CD8+,T 淋巴细胞激活状态:HLA-DR+T、CD4+HLA-DR+、CD8+HLA-DR+、CD4+HLA-DR+/CD4+、CD8+HLA-DR+/CD8+、活化 T 细胞,ELISA 法检测血浆 TNF-α、TGF-β 及 IL-10细胞因子在治疗前后的表达。监测安全性指标。主要疗效指标为再障临床疗效;次要疗效指标包括中医证候总积分改善率、单项中医症状改善率、全血细胞分析。与历史文献进行对照,分析应用健脾补肾法为主与单用西医免疫抑制治疗的疗效差异;通过疗效分层,探究中医证候分型与调控T细胞免疫应答、临床疗效的相关性。根据安全性指标进行安全性评价。研究方案通过北京中医药大学东直门医院伦理委员会批准(DZMEC-KY-2019-133)。初步探索依据脾虚血亏证及肾虚血亏证主要分型应用健脾补肾中药调控T细胞免疫应答治疗慢性再生障碍性贫血的作用机制。结果1.慢性再障中医证候分型与T细胞亚群变化相关,脾虚血亏组免疫应答失调更为突出,CD8+T细胞及Treg细胞比例均高于肾虚血亏组,CD4+/CD8+比值较肾虚血亏组进一步减低。①共纳入慢性再障患者57例,其中脾虚血亏证31例、肾虚血亏证26例。男性患者29例,女性患者28例,平均年龄(54.38±17.58)岁。②与健康对照组比较,慢性再障组CD8+细胞比例显著升高(P<0.05),CD3+、CD4+、Treg细胞比例及CD4+/CD8+比值无明显差异(P>0.05)。③中医证候分型因素相关性分析显示:CD8+、Treg细胞及CD4+/CD8+比值与中医证型相关(P=0.010,P=0.046,P=0.025),脾虚血亏组CD8+、Treg细胞明显高于肾虚血亏组,CD4+/CD8+比值明显低于肾虚血亏组。二元Logistic回归法分析显示,CD8+细胞比例(OR=0.920,95%CI:0.860～0.985,P=0.017)与中医证候分型相关,脾虚血亏组CD8+淋巴细胞较肾虚血亏组升高。④对治疗6月后检测T细胞亚群的32例患者,进行疗效评价,其中缓解6例、明显进步7例,无效19例。与治疗前相比,缓解组CD8+细胞比例显著降低(P<0.05),无效组显著增高(P<0.05),明显进步组无明显变化(P>0.05);治疗后CD4+/CD8+比值无效组进一步降低(P<0.01)。2.以脾虚血亏及肾虚血亏为主要分型,应用健脾补肾中药有助于调控T细胞免疫应答治疗慢性再障,治疗有效患者中,脾虚血亏者治疗后活化T细胞、CD3+HLA-DR+、CD8+HLA-DR+、CD4+HLA-DR+细胞比例、CD8+HLA-DR+/CD8+、CD4+HLA-DR+/CD4+比值较治疗前降低,肾虚血亏者各项T淋巴亚群及激活状态无明显变化。①共纳入慢性再障患者18例,全数据集(FAS)16例,符合方案集(PPS)14例。脾虚血亏组7例,肾虚血亏组9例,两组基线一致。②按照临床疗效判定标准,FAS、PPS总有效率分别为62.5%、71.4%,与国外文献报道有效率(35%-64%)基本一致。脾虚血亏组、肾虚血亏组总有效率分别为71.4%、55.6%,两组间比较无统计学意义(P>0.05)。③按照中医证候疗效评价标准,FAS、PPS证候改善率分别为87.5%、92.9%。脾虚血亏组、肾虚血亏组证候改善率分别为85.7%、88.9%,两组比较无明显差异(P>0.05)。④全血细胞分析:FAS治疗后白细胞计数、中性粒细胞计数、血红蛋白浓度治疗后明显提升(P<0.05,P<0.01);脾虚血亏组和肾虚血亏组治疗前及治疗后各访视点,白细胞计数、中性粒细胞计数、血红蛋白浓度、血小板计数比较均无明显差异(P>0.05)。组内比较,脾虚血亏组在治疗后中性粒细胞明显提升(P<0.05),肾虚血亏组治疗后血红蛋白明显提升(P<0.05)。⑤中医证候总积分:与治疗前相比,FAS治疗3月时、6月时中医证候总积分明显降低(P<0.01)。脾虚血亏组和肾虚血亏组治疗前、治疗3月时、治疗6月时比较无显著差异(P>0.05)。脾虚血亏组与肾虚血亏组治疗3月时、6月时中医证候总积分均较治疗前明显降低(P<0.01)。⑥单项中医症状改善率:治疗6月后单项症状均较治疗前改善,各症状改善率为食欲不振(86.7%)、失眠(83.3%)、大便干结(80.0%)、腰膝酸软(78.6%)、形寒肢冷(77.8%)、盗汗(77.8%)、神疲乏力(73.3%)、头晕(69.2%)、心悸(66.7%)、手足心热(62.5%)、大便稀溏(50.0%)、出血(50.0%)、面色萎黄(46.7%)。⑦T淋巴细胞亚群及激活状态:与治疗前相比,FAS治疗后T淋巴细胞亚群比例及激活状态无明显差异,脾虚血亏组、肾虚血亏组治疗后无明显差异(P>0.05)。按照再障疗效分层统计,有效患者10例,包括脾虚血亏者5例,肾虚血亏者5例。与治疗前比较,有效患者治疗后 CD3+HLA-DR+、CD8+HLA-DR+比例及 CD8+HLA-DR+/CD8+比值明显降低(P<0.05),脾虚血亏者治疗后活化T细胞、CD3+HLA-DR+、CD4+HLA-DR+、CD8+HLA-DR+比例及CD8+HLA-DR+/CD8+、CD4+HLA-DR+/CD4+比值显著降低(P<0.05),肾虚血亏者治疗后T淋巴细胞亚群及激活状态无明显变化(P>0.05)。⑧细胞因子TNF-α、TGF-β、IL-10:FAS、脾虚血亏组与肾虚血亏组治疗后较治疗前均无明显差异,组间比较亦无明显差异(P>0.05)。⑨所有病例未发生严重不良反应。结论慢性再生障碍性贫血中医证候分型与部分T细胞免疫应答具有一定相关性,脾虚与肾虚免疫应答失调的程度不同,健脾补肾法可能通过调控T细胞免疫反应治疗慢性再生障碍性贫血。