论文部分内容阅读
【目的】建立吴茱萸质量标志物(Q-Markers)的研究方法,确定其功效/毒性Q-Markers;建立相关Q-Markers的HPLC含测方法,为吴茱萸的质量控制提供依据。【方法】1.采用超高效液相-四级杆-飞行质谱(UPLC-Q-TOF/MS)对吴茱萸进行全成分分析。根据化合物的色谱保留、准确分子量、特征碎片离子等信息进行质谱解析,明确化学归属。2.应用中药血清药物化学研究方法,确定吴茱萸的入血成分。结合实验室前期的全成分分析、谱效关系研究结果,初步筛选出吴茱萸的功效与毒性成分,明确其药效物质基础,初步框定吴茱萸功效/毒性Q-Markers。3.引入网络药理学研究方法,以初步确定的吴茱萸Q-Markers作为网络药理学的研究对象,采用靶点预测及GO富集等技术发掘其镇痛、止呕与毒性作用的关键靶点,解析其主要作用通路与生物学过程,进而探讨吴茱萸成分-靶点-通路的网络关系,明晰其镇痛、止呕及毒性的作用机制,获得作用机制明确的Q-Markers。4.采用HPLC色谱指纹定性与多指标含量测定相结合的方法,对初步确定的吴茱萸Q-Markers进行可测性评价,建立主要Q-Markers的HPLC含测方法,为后续的质量控制研究提供依据。【结果】1.本文从吴茱萸醇提物中鉴定了80个化学成分,包括生物碱类、柠檬苦素类、黄酮类和有机酸类。2.本文筛查出吴茱萸的入血成分24个,结合谱-效关系研究结果,初步确定了吴茱萸的功效/毒性Q-Markers。镇痛成分为吴茱萸次碱、吴茱萸碱、柠檬苦素、去氢吴茱萸碱、绿原酸、金丝桃苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、吴茱萸宁碱、反式咖啡酰葡萄糖酸、1-甲基-2-正十一烷基-4(1H)-喹诺酮;止呕成分为柠檬苦素、吴茱萸碱、金丝桃苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、1-甲基-2-正十一烷基-4(1H)-喹诺酮;毒性成分为1-甲基-2-[(6Z,9Z)-十五二烯基]-4(1H)-喹诺酮、吴茱萸新碱、1-甲基-2-壬基-4(1H)-喹诺酮、1-甲基-2-[(Z)-6-十一烯基]-4(1H)-喹诺酮、1-甲基-2-[(6Z,9Z,12E)-十五三烯基]-4(1H)-喹诺酮、反式咖啡酰葡萄糖酸和吴茱萸次碱。3.吴茱萸的10个镇痛成分可能是通过BACE1、DPP4、IL2、MAPK14、MMP12、PIM1、INSR、KIT、MET、EGFR等107个镇痛相关靶点调控血管内皮生长因子、蛋白激酶、Toll样受体等信号通路,从而参与氧化应激、炎症反应等过程来发挥治疗疼痛的机制;吴茱萸的4个止呕成分是通过MMP3、CASP3、GSTP1、PDE3B、MMP9、DPP4、ABO、EGFR、KIT、PDE4B、ESR1、THRA、IGF1等29个呕吐相关靶点调控缺氧诱导因子、磷酸二酯酶等信号通路,从而参与RNA聚合酶II启动子转录的正调节、酪氨酸磷酸化Stat5蛋白的正调节、一氧化氮生物合成过程的积极调节等生物过程发挥止呕作用;吴茱萸中8个毒性成分可能是通过CASP1、CASP3、CASP7、SRC、STAT1、CDK6、ANXA5、、DPP4、GSTA1、MAPK14等69个毒性相关靶点调控Ras蛋白、Fox O等信号通路,从而参与细胞凋亡及细胞增殖等生物过程产生毒性。4.建立了主要Q-Markers的HPLC含测方法,方法学结果显示绿原酸、金丝桃苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸卡品碱、二氢吴茱萸卡品碱分别在70.5~1128μg/m L、16.2~259.2μg/m L、11.6~184.7μg/m L、93.6~1500.8μg/m L、20.4~326.4μg/m L、20.23~363.45μg/m L、23.2~371.2μg/m L、7.07~113.13μg/m L范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系;加样回收率分别为101.96%、97.7%、99.4%、99.3%、101.2%、98.7%、100.9%、98.1%;RSD值分别为2.1%、2.4%、2.6%、2.7%、2.1%、2.2%、1.5%、2.7%。【结论】课题组前期已对吴茱萸的谱-效-毒关系进行了系统研究,初步明确了其功效/毒性物质基础。本文首先对吴茱萸进行全成分辨识和血清药物化学研究以进一步探讨吴茱萸的药效物质基础,继以网络药理学方法研究活性成分的作用机制,最后对吴茱萸功效Q-Markers进行了HPLC可测性评价,明确了吴茱萸的功效/毒性Q-Markers,并建立了相关Q-Markers的HPLC含测方法。本文所建立的Q-Markers研究方法体现了中医药整体、全面的特点,可以为中药质量评价提供思路与方法。吴茱萸功效/毒性Q-Markers的确定可以为吴茱萸的后续研究与开发提供依据。