胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发性肿瘤,其中胶质母细胞瘤（GBM）是恶性程度最高的胶质瘤,具有高度的异质性和侵袭性。在临床上,许多类型肿瘤的免疫治疗方案取得了较为成功的突破,尽管GBM采用了包括手术、放化疗、系统性治疗的多模态综合治疗,但是患者总体的生存期仍然短,预后较差,仍然是难以治愈的恶性肿瘤。在临床病理学的检查中,常采用组织石蜡切片染色,例如苏木素-伊红染色,免疫组织化学染色,免疫荧光染色等方法,在二维层面对肿瘤组织进行成像和分析,这些检查方法缺乏对肿瘤空间异质性的表征。随着肿瘤异质性研究的深入,肿瘤微环境的三维空间结构的表征成为其研究的重点,细胞的不同三维空间分布以及形态结构可能决定着细胞的不同状态和功能。组织的连续薄切片能够初步实现三维图像的重建,但需要较大的工作量,图像的配准并不能很好的解决每张二维切片的差异,并且因无法避免机械操作带来的组织块物理损伤,从而造成结果的不准确。近年来发展的组织透明技术,能避免繁琐的切片,使大型组织块或器官变得透明,以便对感兴趣的分子或细胞进行深度的三维成像,与之相匹配的光学显微技术例如激光共聚焦扫描显微镜、光片显微镜、多光子显微镜等能够通过“光学切面”扫描和图像重建对样本进行三维成像。本研究拟通过对肿瘤组织块进行透明化处理以及染色,结合特异性荧光标记、共聚焦显微镜扫描和图像三维重建分析技术,建立基于组织透明技术的胶质瘤微环境三维可视化研究体系,以胶质瘤血管、胶质瘤内微生物三维可视化为研究重点,突出了组织透明化三维成像在临床样本中的应用潜力。第一章基于组织透明技术的胶质瘤血管三维可视化研究方法:使用10%中性福尔马林对人脑胶质瘤手术切除样本进行固定,用CD31抗体对胶质瘤血管进行标记,再经过OPTIClear进行透明化处理,并使用激光共聚焦显微镜进行扫描,再使用iMaris软件对图像进行后期处理,并量化分析不同级别胶质瘤血管结构。结果:在使用OPTIClear透明化以及CD31免疫标记后,能够对胶质瘤血管进行三维成像。对比二维图像,组织透明化成像能完整显示血管的三维结构,并能通过软件进行可靠的定量分析。第二章基于组织透明技术的脑胶质瘤中微生物三维可视化研究方法:应用OPTIClear组织透明技术,将人脑胶质瘤手术切除的组织块进行透明化处理,用细菌细胞壁脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）单克隆抗体对细菌进行特异性免疫标记后,并使用激光共聚焦显微镜以及多光子激光扫描显微镜对肿瘤组织深部的细菌LPS信号进行成像。同时,采用传统组织病理学方法检测LPS信号以及16s rRNA作为对照。综合以上证据链,在排除样本表面污染的前提下,进行人脑胶质瘤微生物的三维可视化研究。结果:成功建立了基于组织透明技术三维可视化胶质瘤内细菌的方法,通过此方法,检测到了人脑肿瘤内存在特异性细菌LPS特异性信号,其主要存在于细胞内,散在分布,没有固定的形态。综上,组织透明技术在实体肿瘤上的应用可能会改变我们对肿瘤内部结构的认知,相较于二维组织病理切片而言,组织透明化三维成像能够提供更丰富的组织结构信息和细胞异质性信息,这对于揭示肿瘤微环境中信号网络和细胞间相互作用的研究至关重要。尤其,当联合二维和三维的方法研究组织原位的相关分子信息时,将会更有见解地阐明肿瘤的发生发展机制,并为肿瘤诊断提供了一个强有力的新策略。