论文部分内容阅读
水稻白叶枯病是由黄单胞菌水稻变种Xoo(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)引起的一种危害严重的维管束病害,最经济有效的防治方法是种植抗病品种。隐性抗病基因能提供更持久稳定的广谱抗性,但目前已克隆的水稻隐性抗白叶枯病基因只有3个。xa5是隐性抗白叶枯病基因,其蛋白产物是真核生物转录因子TFIIA的gamma小亚基类蛋白。xa5和病原菌的无毒蛋白avrxa5专一性结合,从而可能介导稻株的抗病反应。与此相反,Xa5是其显性等位基因,介导植株的易感性。因此,无论是为了降低植物的易感性还是为了提高其抗病性,都有必要高效地抑制Xa5的表达。基因编辑技术为作物的育种提供了新的途径,它是利用序列特异性核酸酶原位地对基因进行改造,引入的外源基因也能在后代中通过自然的遗传分离而全部去除。 本研究工作利用基因编辑技术对TP309、D62B、MH86和IR24四种遗传背景的水稻材料进行了改造,通过序列特异性核酸酶TALEN对基因Xa5进行原位编辑,获得了基因Xa5敲除的突变体苗。通过遗传筛选,去除了TALEN外源基因残留,最终得到了基因Xa5原位敲除、遗传稳定的水稻新材料。在大田进行的大规模接种检测表明,这些基因敲除的水稻材料对白叶枯菌PXO86的易感性明显下降,而且这种抗病性提高的趋势在不同年份和不同生长环境下完全一致。 在研究中,我们发现了TALEN在实践(育种)应用中的一些作用特点:1、同一个TALEN能对多种遗传背景的水稻材料进行基因编辑,在T0代转基因苗中获得靶基因突变体的机率约为20-30%。2、TALEN作用具有持续性,只要识别的靶序列存在,TALEN就持续切割靶基因;3、在转基因T1代苗中就能获得无TALEN基因残留、遗传稳定的靶基因纯合突变体苗;4、从转基因T0代到T1代,靶基因突变的遗传率波动范围极大,甚至可以达到0或者100%。5、同一个突变体中靶基因会出现多种突变类型,不同遗传背景的突变体靶基因也会出现相同的突变类型。6、TALEN存在脱靶现象,一对靶序列在间隔序列长度不变的情况下,每个靶序列都有4个不匹配的碱基也能出现脱靶。 此外,本论文的研究表明:1、Xa5编码蛋白是一种感病因子,参与了植物的感病,敲除基因Xa5能降低水稻对白叶枯病菌的易感性;2、Xa5蛋白第32位氨基酸至关重要,该位氨基酸的改变会造成蛋白感病功能的丧失。 在己获得的基因Xa5敲除的水稻材料中,我们又转入了抗病基因xa5,结果水稻材料的抗病性进一步提高,证明Xa5和xa5蛋白通过不同途径影响水稻的抗病。 最后,我们发现基因Xa5的同源基因Os TFIIAγ1极为重要,该基因的任何突变均会影响水稻的生活力,导致不育或死亡。