论文部分内容阅读
目的:分别以海地瓜多肽、枸杞子中的大极性抗氧化活性成分和枸杞多糖为研究对象,建立HSCCC法从复杂体系中分离制备多肽、多糖等大极性化合物的分离方法,为开展逆流色谱分离大极性天然产物的相关研究提供一定的技术支撑。方法:（1）基于双水相系统的高速逆流色谱对海地瓜多肽分离方法的研究:海地瓜多肽依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,以α-淀粉酶抑制率为指标,对正丁醇部位和水部位的降糖活性进行评价。正丁醇部位经HSCCC分离,以固定相保留率为指标对溶剂系统、流速、转速等色谱条件进行优化,以制备所得馏分α-淀粉酶抑制率为指标对洗脱方式进行筛选。在最佳条件下所得馏分经Prep-HPLC进一步分离纯化得到单体化合物,利用HPLC对其纯度进行检测。ESI-MS/MS对所分离化合物的结构进行分析,经Mascot软件与质谱数据库对照,对化合物的结构进行推测,并测定它们的α-淀粉酶抑制活性。（2）基于双水相系统的高速逆流色谱对枸杞水提物中大极性抗氧化活性成分分离方法的研究:在DPPH-HPLC筛选抗氧化活性成分的实验对比下,以溶剂系统沉降时间和枸杞子水提物在HSCCC溶剂系统两相中DPPH清除率之比为指标筛选溶剂系统,以固定相保留率和制备所得组分DPPH清除率为指标对流速和转速等色谱条件进行优化。在最优条件下对枸杞水提物进行分离,后经Prep-HPLC进一步分离纯化得到单体化合物,利用HPLC检测化合物的纯度,运用~1H-NMR和13C-NMR等手段对分离得到的化合物进行结构鉴定,并测定它们的DPPH清除能力。（3）基于双水相系统的高速逆流色谱对枸杞多糖分离方法的研究:采用浊点滴定法绘制PEG-盐ATPS的相图,以ATPS上下相体积比、沉降时间、枸杞粗多糖分配系数等参数对PEG-K2HPO4和PEG-（NH4）2SO4ATPS的组成及比例进行筛选。以固定相保留率为指标,单因素试验优化HSCCC流速、转速等色谱条件,在最佳色谱条件下,HSCCC对枸杞水提物进行分离,按照多糖洗脱曲线对馏分进行合并。最后采用硫酸-苯酚法测定分离所得组分中的多糖含量,对其纯度进行初步检测。结果:（1）基于双水相系统的高速逆流色谱对海地瓜多肽分离方法的研究:海地瓜多肽正丁醇萃取部位α-淀粉酶抑制活性(IC50=1.19±1.04mg/m L)大于水部位(IC50=2.12±0.98 mg/m L)。HSCCC对正丁醇部位分离的最优色谱条件为:溶剂系统:异丙醇-乙腈-乙醇-水-饱和硫酸铵0.3:0.5:0.5:0.7:2,v/v/v/v/v;转速:900 rpm;流速2.0 m L/min;温度:30.0℃;检测波长:214 nm;进样量:500 mg;洗脱方式:尾到头。最终分离得到2个多肽化合物,经鉴定其结构可能为AGRDLTDYLMK和IGSVFESVNR。前者抑制α-淀粉酶的IC50值为5.82±0.96 mg/m L,后者抑制α-淀粉酶的IC50值为9.93±1.36 mg/m L。（2）基于双水相系统的高速逆流色谱对枸杞水提物中大极性抗氧化活性成分分离方法的研究:与空白组相比,加入DPPH后未发现峰面积明显降低的色谱峰。枸杞水提物经HSCCC一步分离得到两个抗氧化活性部位,分离的最佳色谱条件为:溶剂系统:乙醇:硫酸铵:水28.1:20.3:51.6w/w/w;流速:1.5 m L/min;转速:900 rpm;温度:25.0℃;检测波长:214 nm;进样量:200 mg;洗脱方式:头到尾（洗脱挤出）。所得抗氧化活性部位的DPPH清除能力分别为枸杞水提物的2.0174倍和2.5397倍。最终从抗氧化活性部位中分离得到2个化合物:芦丁和（2S）-脯氨酸。其中芦丁清除DPPH的IC50值为21.70±1.03μg/m L,而（2S）-脯氨酸的DPPH清除能力较弱。（3）基于双水相系统的高速逆流色谱对枸杞多糖分离方法的研究:HSCCC从枸杞水提物中分离枸杞多糖的最佳色谱条件为:溶剂系统:PEG400-（NH4）2SO4-H2O（30%-20%-50%,w/w/w）;转速:900 rpm;流速:1.0 m L/min;温度:25.0℃;进样量:1.2 g;洗脱方式:头到尾。最终从枸杞水提物中一步分离得到2个枸杞多糖:LBP-1 13.4 mg和LBP-2 11.8mg,LBP-1中多糖的含量为87.24%（RSD=1.16,n=3）,LBP-2中多糖含量为92.34%（RSD=1.52,n=3）。结论:基于异丙醇-乙腈-乙醇-水-饱和硫酸铵ATPS的HSCCC能提供更高的固定相保留,与Prep-HPLC结合用于海地瓜纯多肽制备的方法操作简单,可应用于大规模生产。HSCCC结合DPPH-HPLC法无法实现枸杞水提物中大极性抗氧化成分的筛选与分离,而基于两相溶剂系统DPPH清除率之比作为K值筛选的ATPS用于HSCCC分离的方法可实现枸杞水提物中大极性抗氧化活性部位的快速分离制备。基于PEG400-（NH4）2SO4ATPS的HSCCC直接用于枸杞水提物的中多糖的分离方法可实现多糖与多糖的一步分离制备,可减少分离方法对多糖结构的影响,且分离所得多糖的纯度较高。本研究为HSCCC法从复杂天然产物中快速分离制备大极性化合物提供了一定的参考。