随着医学模式从单一的生物医学模式向生物-心理-社会模式转变,心理社会因素对癌症患者的影响备受关注。心理压力在人群中非常普遍,并成为包括心血管疾病、抑郁症和癌症在内的多种疾病的重要危险因素,极大地损害了癌症患者的身心健康。慢性应激是指机体反复或长期处在“过度驱使”状态,而不能调整和稳定内稳态时所经历的持续的情感变化及心理压力,与焦虑、抑郁和认知功能障碍相关。胃癌是全球常见的恶性肿瘤之一,严重影响人类健康。诸多证据显示,慢性应激会加速胃癌患者的恶性进展,但其调控的分子机制尚不清楚。在慢性应激条件下,下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA）和交感神经系统（sympathetic nervous system,SNS）释放大量应激相关激素,如糖皮质激素和儿茶酚胺类激素（肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺等）,从而动员身体进行“战斗或逃跑”反应。这两条途径有一个共同的作用靶点-肾上腺素能受体。研究发现,慢性应激主要通过β2-肾上腺素能受体（β2 adrenergic receptor,β2-AR）发挥促进肿瘤恶性进展的作用。虽然已知β2-AR在慢性应激影响肿瘤进展过程中可能发挥关键性作用,然而对于临床治疗而言,由于β2-AR的抑制剂（如普萘洛尔等）用于治疗心血管疾病,存在普遍的心血管副作用,无法用于逆转慢性应激的临床用药。因此,针对HPA、SNS的关键靶点或其作用的信号通路进行深入研究,以期通过逆转慢性应激来延缓甚至阻滞肿瘤的恶性进展,不失为肿瘤治疗研究的一条新思路。PlexinA1作为信号素家族受体之一,是单次通过膜结合的信号素,最初被确定为轴突导向因子。PlexinA1可与其配体结合,在中枢神经系统中及肿瘤的生长、转移和血管生成中具有重要作用,也可独立发挥生物学作用。研究表明PlexinA1与慢性应激具有相关性,我们前期研究表明慢性应激通过β2-AR促进胃癌细胞PlexinA1的表达,由此猜测β2-AR与PlexinA1在慢性应激介导的胃癌恶性进展中具有相关性。肿瘤的恶性进展是一个序贯的过程:肿瘤细胞通过上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）发生形态和功能的改变,脱离原发灶并突破基底膜发生迁移和侵袭,可通过血行播散并在远处器官靶向定植。在此过程中,血管不仅提供肿瘤生长所需的营养物质,还作为肿瘤转移的重要通道。因此,EMT及微环境中的肿瘤血管生成是影响肿瘤恶性进展的关键因素。研究发现,慢性应激可通过肾上腺素激活β2-AR调节肿瘤细胞的EMT和血管生成来促进肿瘤的恶性进展,但与β2-AR作用密切相关的分子靶点及其下游潜在的分子机制尚不清楚。本研究以人胃癌细胞MGC-803和SGC-7901及血管内皮细胞EA.hy926为研究对象,旨在阐明肾上腺素激活β2-AR/PlexinA1影响胃癌细胞EMT及肿瘤血管生成过程中,PlexinA1是如何发挥重要作用的。第一部分体外慢性应激模型的构建及慢性应激诱导胃癌细胞的EMT过程、迁移能力和血管生成目的:体外建立慢性应激模型,并探究慢性应激可以诱导胃癌细胞的EMT过程、迁移能力和血管生成。方法:1.用0、2、10、20μM浓度的β2-AR激动剂异丙肾上腺素（Isoproterenol,ISO）或0、20、40、50μM浓度的β2-AR拮抗剂ICI118,551（ICI）作用于胃癌细胞12h,分别提取细胞的总蛋白,利用Western blot技术检测β2-AR在胃癌细胞中的蛋白表达情况;2.以0、2、10、20μM浓度的ISO或0、20、40、50μM浓度的ICI作用于胃癌细胞12h,利用Western blot技术检测PlexinA1在胃癌细胞中的蛋白表达情况;3.20μM浓度的ISO和50μM浓度的ICI作用于胃癌细胞12h后,利用免疫荧光（Immunofluorescence,IF）技术检测β2-AR、PlexinA1在胃癌细胞中的荧光表达量情况;4.0、2、10、20μM 浓度的 ISO 或 0、20、40、50μM 浓度的 ICI 作用于胃癌细胞12h,分别提取细胞的总蛋白,利用Western blot技术检测EMT 标志物（E-cadherin、N-cadherin、ZEB-1、Vimentin、Snail、Slug 和α-SMA）在胃癌细胞中的蛋白表达情况;5.20μM浓度的ISO和50μM浓度的ICI作用于胃癌细胞后,利用划痕实验检测胃癌细胞的迁移能力;6.0、5、10μM浓度的ISO与l0μM浓度的ICI作用于血管内皮细胞,成管实验检测血管内皮细胞的成管能力;7.以P＜0.05为差异有统计学意义。结果:1.Western blot结果显示,ISO作用胃癌细胞后,胃癌细胞中β2-AR表达水平明显上调,以ISO 20μM浓度作用更明显;ICI作用于胃癌细胞后,胃癌细胞中β2-AR表达被抑制,以ICI50μM浓度作用显著;2.Westernblot结果表明,浓度梯度的ISO作用后,PlexinA1的蛋白表达随着体外慢性应激状态构建成功而增高,以ISO 20μM浓度作用更明显;同时PlexinA1伴随着体外慢性应激被ICI阻滞而表达下调,以ICI 50μM浓度更显著,且PlexinA1的蛋白表达趋势伴随β2-AR的蛋白变化而发生变化;3.免疫荧光结果显示,ISO可以促进β2-AR的表达,ICI作用降低β2-AR的表达;同时ISO作用明显增加PlexinA1的表达,ICI降低PlexinA1的表达;4.Western blot结果显示,ISO作用胃癌细胞后,胃癌细胞中上皮标志物 E-cadherin表达下调,间质标志物 N-cadherin、ZEB-1、Vimentin、Snail、Slug和α-SMA表达上调,以ISO 20μM浓度作用更明显;ICI作用于胃癌细胞后,胃癌细胞中上皮标志物E-cadherin表达上调,间质标志物N-cadherin、ZEB-1、Vimentin、Snail、Slug 和α-SMA 表达被抑制,以ICI 50μM浓度作用显著;5.划痕实验结果显示,ISO可以增强胃癌细胞的迁移能力,ICI作用后减弱胃癌细胞的迁移能力;6.成管实验结果显示ISO作用于血管内皮细胞后促进血管内皮细胞形成小管,而ICI作用后抑制小管形成。小结:慢性应激体外模型构建成功,ISO可以诱导胃癌细胞的慢性应激,ICI作用可以有效模拟体外慢性应激被阻滞的状态;慢性应激促进β2-AR表达增高的同时,会引起PlexinA1蛋白表达增高,并伴随着体外慢性应激被阻滞而表达下调;ISO模拟的慢性应激可以促进胃癌细胞的EMT过程、迁移能力和血管生成,ICI作用可以抑制胃癌细胞的EMT过程、迁移能力和血管生成。第二部分慢性应激依赖PlexinA1,并通过与β2-AR相互作用影响胃癌细胞的EMT过程、迁移能力和血管生成目的:探索慢性应激促进胃癌细胞EMT过程、迁移能力和血管生成过程中,PlexinA1发挥的重要作用及其与β2-AR的相互作用。方法:1.利用慢病毒介导的shRNA靶向干扰PlexinA1转染胃癌细胞,流式细胞术检测慢病毒的转染效率,Western blot检测干扰胃癌细胞的PlexinA1后PlexinA1的蛋白表达情况;2.慢病毒干扰胃癌细胞中PlexinA1的表达,利用Western blot技术检测胃癌细胞中的EMT标志物（E-cadherin、N-cadherin、ZEB-1、Vimentin、Snail、Slug和α-SMA）的表达情况;3.干扰胃癌细胞中PlexinA1的表达,利用免疫荧光法检测胃癌细胞中EMT标记物E-cadherin、Vimentin、α-SMA的表达情况;4.慢病毒干扰胃癌细胞中PlexinA1后,划痕实验及Transwell实验检测胃癌细胞的迁移能力;5.利用慢病毒干扰胃癌细胞中PlexinA1的表达,收取胃癌上清液,放射免疫法检测胃癌细胞分泌VEGF水平;6.利用慢病毒干扰胃癌细胞中PlexinA1的表达,收取胃癌上清液培养血管内皮细胞,CCK-8法检测血管内皮细胞EA.hy926的增殖能力;7.利用慢病毒干扰胃癌细胞中PlexinA1的表达,收取胃癌上清液培养血管内皮细胞,Transwell法检测血管内皮细胞EA.hy926的迁移能力;8.利用慢病毒干扰胃癌细胞中PlexinA1的表达,收取胃癌上清液培养血管内皮细胞,成管实验检测血管内皮细胞EA.hy926的成管能力;9.20μM浓度的ISO作用于胃癌细胞12h,免疫荧光技术检测β2-AR、PlexinA1在胃癌细胞中的表达情况;10.免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）及 Western blot 法检测β2-AR与PlexinA1的相互作用情况;11.以P＜0.05为差异有统计学意义。结果:1.流式细胞术结果表明细胞转染率达70%,Western blot结果显示胃癌细胞中的PlexinA1蛋白表达被成功抑制;2.Western blot结果表明,ISO作用胃癌细胞后,胃癌细胞中上皮标志物 E-cadherin 表达下调,间质标志物 N-cadherin、ZEB-1、Vimentin、Snail、Slug和α-SMA表达上调;干扰胃癌细胞中PlexinA1后,抑制慢性应激介导的胃癌细胞EMT,表现为上皮标志物E-cadherin表达上调,间质标志物 N-cadherin、ZEB-1、Vimentin、Snail、Slug 和α-SMA 表达被抑制;3.免疫荧光结果显示,干扰PlexinA1抑制慢性应激介导的胃癌细胞EMT过程,即胃癌细胞干扰PlexinA1后E-cadherin表达增多,Vimentin、α-SMA的表达减少;4.划痕及Transwell结果表明,干扰胃癌细胞PlexinA1可抑制胃癌细胞的迁移能力;5.放射免疫结果显示,干扰胃癌细胞PlexinA1的表达,其分泌VEGF水平降低;6.CCK-8结果显示,干扰胃癌细胞PlexinA1的表达,降低其上清所培养的血管内皮细胞的增殖能力;7.Transwell结果显示,干扰胃癌细胞PlexinA1的表达,降低其上清所培养的血管内皮细胞的迁移能力;8.成管实验结果显示,干扰胃癌细胞PlexinA1的表达,其上清所培养的血管内皮细胞的成管能力明显被抑制;9.免疫荧光结果显示,β2-AR与PlexinA1在胃癌细胞中存在共定位现象,并且ISO作用促进二者共定位;10.免疫共沉淀结果显示,在胃癌细胞中β2-AR和PlexinA1存在相互作用。小结:慢性应激通过β2-AR与PlexinA1的相互作用,一方面促进胃癌细胞EMT过程,进一步增加胃癌细胞的迁移能力;另一方面通过影响VEGF的分泌,促进血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力进而促进胃癌的血管生成。第三部分慢性应激通过β2-AR/PlexinA1激活JAK2-STAT3信号通路促进胃癌细胞的EMT、迁移能力和血管生成目的:探究JAK2-STAT3信号通路在慢性应激促进胃癌细胞的EMT、迁移能力和血管生成中的作用。方法:1.利用慢病毒干扰胃癌细胞中PlexinA1的表达,检测JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3在胃癌细胞中的蛋白表达水平;2.利用JAK2抑制剂AG490（20μM,12h）,STAT3磷酸化抑制剂Stattic（20μM,12h）作用于胃癌细胞,Western blot 验证 β2-AR、PlexinA1、JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3的表达;3.利用JAK2抑制剂AG490（20μM,12h）,STAT3磷酸化抑制剂Stattic（20μM,12h）作用于胃癌细胞,Western blot检测EMT标记物（E-cadherin、N-cadherin、ZEB-1、Vimentin、Snail、Slug 和α-SMA）的表达;4.利用免疫荧光法检测JAK2-STAT3抑制剂对胃癌的EMT标记物E-cadherin、Vimentin、Slug和α-SMA表达水平的影响;5.利用划痕实验检测JAK2-STAT3抑制剂对胃癌细胞迁移能力的影响;6.JAK2-STAT3信号通路抑制剂作用于胃癌细胞,提取胃癌上清液,放射免疫法检测胃癌细胞分泌VEGF水平;7.利用JAK2-STAT3信号通路抑制剂作用胃癌细胞,收取胃癌上清液培养血管内皮细胞,CCK-8法检测血管内皮细胞EA.hy926的增殖能力;8.利用JAK2-STAT3信号通路抑制剂作用胃癌细胞,收取胃癌上清液培养血管内皮细胞,Transwell法检测血管内皮细胞EA.hy926的迁移能力;9.利用JAK2-STAT3信号通路抑制剂作用胃癌细胞,收取胃癌上清液培养血管内皮细胞,成管实验检测血管内皮细胞EA.hy926的成管能力;10.以P＜0.05为差异有统计学意义。结果:1.Western blot结果提示,在慢性应激过程中,胃癌细胞干扰PlexinA1后JAK2-STAT3信号通路的激活被抑制;2.Western blot结果表明,JAK2-STAT3信号通路抑制剂明显抑制JAK2-STAT3 的激活,以 JAK2 抑制剂 AG490（20μM,12h）,STAT3 磷酸化抑制剂Stattic（20μM,12h）作用最为显著;3.Western blot结果显示,ISO作用胃癌细胞后,胃癌细胞中上皮标志物 E-cadherin 表达下调,间质标志物 N-cadherin、ZEB-1、Vimentin、Snail、Slug和α-SMA表达上调;利用JAK2-STAT3信号通路抑制剂作用胃癌细胞后上皮标志物E-cadherin表达上调,间质标志物N-cadherin、ZEB-1、Vimentin、Snail、Slug 和α-SMA 表达被抑制;4.免疫荧光结果显示,ISO作用胃癌细胞后,胃癌细胞中上皮标志物E-cadherin表达下调,间质标志物Vimentin、Slug和α-SMA表达上调;JAK2-STAT3信号通路的抑制剂作用胃癌细胞后E-cadherin表达增多,Vimentin、Slug 和α-SMA 的表达减少;5.划痕实验结果显示,在慢性应激过程中,利用JAK2-STAT3信号通路的抑制剂可明显抑制胃癌细胞的迁移能力;6.放射免疫结果显示,在慢性应激过程中,利用JAK2-STAT3信号通路的抑制剂作用于胃癌细胞,胃癌细胞分泌VEGF水平降低;7.CCK-8结果显示,在慢性应激过程中,胃癌细胞中JAK2-STAT3信号通路的抑制,可抑制其上清培养的血管内皮细胞的增殖能力;8.Transwell结果显示,在慢性应激过程中,胃癌细胞中JAK2-STAT3信号通路的抑制,可抑制其上清培养的血管内皮细胞的迁移能力;9.血管内皮成管实验结果显示,在慢性应激过程中,胃癌细胞中JAK2-STAT3信号通路的抑制,可抑制其上清培养的血管内皮细胞的成管能力。小结:慢性应激通过β2-AR/PlexinA1激活JAK2-STAT3信号通路,促进胃癌细胞的EMT、迁移能力和血管生成。