论文部分内容阅读
目的:冠心病（coronary heart disease,CHD）是我国常见的心血管疾病,急性心肌梗死是CHD的严重类型,常危及患者生命。尽管冠脉介入、冠状动脉旁路移植术及药物改善了患者的生存率,但手术后靶血管再狭窄、长期心肌缺血心肌细胞坏死引起的心室重构等仍需解决。内皮细胞的损伤与CHD的发生及进展密切相关,人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）是血管系统和血管生成研究中广泛使用的原代内皮细胞。micro RNA对内皮细胞的调控受到广泛关注,micro RNA参与细胞凋亡、分化、增殖、周期调控等重要的细胞功能活动。据报道miR-195在心血管疾病中起着关键作用、参与细胞凋亡过程。但是miR-195是否能够促进内皮细胞增殖,进而促进心肌周围血管生成,构建有效侧枝循环,减少细胞凋亡目前尚属未知,因此本课题以内皮细胞系中代表细胞株HUVEC为研究对象:研究miR-195-3p是否参与缺氧损伤;通过外源性抑制miR-195-3p,检测下调miR-195-3p是否能部分逆转HUVEC细胞缺氧损伤。以期更深入了解CHD血管新生障碍的机制,为CHD的治疗提供新靶标。方法:1.应用日本三菱安宁包缺氧体系,建立HUVEC细胞的缺氧模型。取对数生长期的HUVEC细胞分为2组:（1）control组:DMEM低糖培养基,培养6h;（2）hypoxia 6h组:DMEM低糖培养基,缺氧培养6h。免疫印迹法（Western Blotting,WB）检测缺氧诱导因子-1a（hypoxia inducible factor-1a,HIF-1a）蛋白质的表达,RT-q PCR检测miR-195-3p及miR-195-5p的表达水平。EDU、CCK-8、集落形成实验检测细胞增殖能力;划痕愈合及transwell实验,检测细胞迁移能力;TUNEL检测凋亡情况;WB检测自噬蛋白LC3B和凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax,Cleaved caspase-3/Caspase-3,Cytochrome C的表达。2.应用质粒转染技术,建立人HUVEC细胞转染模型。取对数生长期的HUVEC细胞分为2组:（1）miR-195-3p inhibitor（抑制剂）组:通过脂质体转染miR-195-3p抑制剂;（2）miR-195-3p inhibitor NC组:转染miR-195-3p抑制剂的阴性对照组。培养48h后,RT-q PCR检测各转染后组miR-195-3p表达水平,验证细胞转染效能。3.建立人HUVEC细胞的缺氧+转染模型。取对数期生长的HUVEC细胞,分为3组:（1）control组:常规培养6h;（2）hypoxia 6h组:缺氧培养6h;（3）hypoxia 6h+miR-195-3p inhibitor组:通过脂质体转染miR-195-3p抑制剂后,应用1%FBS培养基培养48h,更换DMEM低糖培养基,继续缺氧培养6h。EDU、CCK-8、集落形成实验检测细胞增殖能力;划痕愈合及transwell实验,检测细胞迁移能力;TUNEL检测凋亡情况;WB检测自噬蛋白LC3B和凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax,Cleaved caspase-3/Caspase-3,Cytochrome C的表达。结果:1.细胞缺氧6h后,与control组相比,细胞形态发生改变,HIF-1a蛋白质的表达上升（P＜0.001）。与control组相比,RT-q PCR结果显示,缺氧6h后,miR-195-5p表达水平无统计学意义（P=0.6576）,miR-195-3p表达水平升高（P＜0.05）。CCK8、EDU细胞增殖实验及集落形成实验显示:缺氧损伤后细胞的增殖能力减弱。划痕愈合及transwell实验显示:缺氧损伤后细胞的迁移能力减弱。TUNEL细胞凋亡实验及WB检测凋亡相关蛋白质显示:缺氧损伤后细胞的凋亡增加。WB检测LC3B蛋白质表达减弱。2.细胞转染效率:转染miR-195-3p抑制物后,与miR-195-3p抑制物NC对照组相比,miR-195-3p表达下调（p＜0.01）。3.转染miR-195-3p抑制物后,再进行6h缺氧损伤:CCK8、EDU细胞增殖实验及集落形成实验显示:加入miR-195-3p抑制物后细胞的增殖能力较单纯缺氧组提高。划痕愈合及transwell实验显示:细胞的迁移能力较单纯缺氧组增强。TUNEL细胞凋亡实验及WB检测凋亡相关蛋白显示:加入miR-195-3p抑制物后细胞的凋亡较单纯缺氧组减少。WB检测自噬相关蛋白显示:加入miR-195-3p抑制物后细胞的自噬能力较单纯缺氧组增强。结论:1.miR-195-3p参与HUVEC细胞的缺氧损伤,导致细胞的增殖、迁移、自噬能力降低,细胞凋亡增多。2.miR-195-3p抑制物可部分逆转HUVEC细胞的缺氧损伤,增强细胞的迁移、增殖、自噬能力,减少细胞凋亡。