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单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM),简称单增李斯特菌,是一种革兰氏阳性胞内病原菌,可在多种细胞中增殖。李斯特菌感染宿主细胞后可以通过两种不同的主要组织相容性复合体(MHC I和MHC II)途径激活机体适应性细胞免疫反应。由于李斯特菌独特的细胞内感染机制,因此通过基因改造获得减毒李斯特菌作为一种新型的抗原递送活载体已广泛用于肿瘤的免疫治疗研究。我们团队前期研究发现,突变李斯特菌重要毒力因子溶血素LLO(由hly基因编码)上2个关键氨基酸位点后细菌毒力大大降低,但仍保留了部分在细胞内增殖能力,因此本研究主要基于LLO关键活性位点改造获得减毒李斯特菌抗原递送载体,并用于小鼠宫颈癌模型的免疫治疗效果评价。本研究以单增李斯特菌参考菌株EGD-e为背景菌株,利用氨基酸突变和同源重组技术直接在李斯特菌hly基因上进行遗传操作,获得了减毒李斯特菌(LADS),并通过分子生物学、细胞生物学和感染生物学等手段对该毒株的生物特性和安全性开展评价。研究发现:LADS能正常在BHI培养基中生长,能够稳定合成和分泌LLO突变蛋白,但其分泌的LLO由于关键活性位点突变而丧失了大部分蛋白活性;LADS能在成纤维细胞(L929)中正常增殖和迁移,虽不能在巨噬细胞中复制增殖,但仍可刺激巨噬细胞产生肿瘤免疫相关炎性因子(IL-1β,IL-6,TNF-α和IL-10);LADS毒力高度致弱,其在小鼠感染模型中的半数致死量(LD50)比野生株高近10000倍,基本符合减毒疫苗载体的生物安全性。基于该减毒李斯特菌,采用同源重组方法将引起人宫颈癌主要毒株HPV 16的肿瘤相关抗原E7无缝克隆至LADS的hly基因C端,获得肿瘤治疗候选疫苗(LADSE7)。试验发现,LADS-E7成功表达分泌LLO-E7重组融合突变蛋白,且具备正常的体外生长能力。将宫颈癌肿瘤细胞TC-1接种C57BL/6小鼠构建得到鼠肿瘤模型,并利用尾静脉注射LADS-E7进行肿瘤免疫治疗效果评价。结果显示,LADS-E7两次免疫后能显著抑制肿瘤生长,其中部分小鼠体内肿瘤已完全消失;流式细胞仪检测发现,LADS-E7治疗组小鼠脾细胞中的CD4+和CD8+T细胞比例较对照组(PBS或LADS)明显升高,Treg细胞明显降低,说明LADS-E7免疫治疗主要通过激活小鼠T细胞免疫反应进而达到抑制和杀伤肿瘤的效果。综上,本研究首次采用毒力因子关键氨基酸位点不可逆突变的方式构建减毒李斯特菌LADS,最大化地保留了李斯特菌的感染特性和免疫原性,减毒效果显著且无抗性基因等标记引入,更符合疫苗载体的生物安全性。该疫苗载体在小鼠HPV肿瘤模型中展现出了良好的治疗效果。本研究有望为包括人宫颈癌在内的肿瘤免疫治疗提供创新、高效的方法和策略,具有非常大的应用前景。