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研究背景:嘌呤能2X7受体(P2X7R)是ATP门控的离子通道,能够实现对胞外信号的传导,引起相应的生物学效应。P2X7R涉及细胞因子释放和调节一系列与炎症相关的信号通路,在炎症和疼痛中的作用已被广泛研究。兴奋P2X7R可使得胶质细胞活化,增加胶质细胞白介素-1β和肿瘤坏死因子-α等细胞因子的释放从而引发慢性痛,而抑制P2X7R可减轻炎性痛和慢性神经病理痛。瞬时感受器电位香草酸受体1(TRPV1)是一种非选择性阳离子通道,维持机体的正常生理功能。研究表明,TRPV1可能在神经元凋亡和坏死中起作用,TRPV1活性以及表达增加,会促进参与慢性疼痛的感觉神经元的损伤,从而导致痛觉过敏。已有大量研究表明,P2X7R和TRPV1都与疼痛的调控密切相关,在整体动物水平实验,我们发现下调P2X7R可缓解糖尿病大鼠的痛觉过敏,并调节体内炎症因子的释放和降低糖尿病神经病理痛大鼠背根神经节(DRG)中TRPV1的表达。因此,本项目将在细胞水平上,进一步探索高糖高脂(HGHF)环境中下调卫星胶质细胞P2X7R对神经元TRPV1的影响及其可能的机制,其研究成果将为糖尿病神经病理痛的发病机制提供实验基础和理论依据。目的:本实验在HGHF环境下,用P2X7 sh RNA下调卫星胶质细胞(SGCs)的P2X7R,通过共培养的方法探究对其神经元TRPV1表达的影响。方法:构建原代培养卫星胶质细胞HGHF模型,检测P2X7 sh RNA细胞转染后卫星胶质细胞和神经元相关指标和受体的变化。实验分组:正常组(Control)、HGHF模型组(HGHF)、HGHF模型加P2X7 sh RNA处理组(HGHF+P2X7sh RNA)、HGHF模型加NC sh RNA处理组(HGHF+NC sh RNA)(1)利用实时荧光定量PCR技术,检测各组卫星胶质细胞P2X7 m RNA和神经元TRPV1 m RNA的表达水平;(2)利用免疫荧光技术,检测卫星胶质细胞上P2X7R与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)共表达水平,检测神经元上TRPV1与神经元核心抗原(Neu N)共表达水平。(3)通过蛋白印迹实验检测各组卫星胶质细胞中P2X7R、磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶p38(P-p38)、磷酸化核转录因子p65(P-p65)、肿瘤坏死因子ɑ(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β),神经元中TRPV1、蛋白激酶C-?(PKC-?)、磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶p38(P-p38)的表达;(4)用BBcell Probe F03检测卫星胶质细胞和神经元内Ca2+相对含量;(5)用ELISA检测卫星胶质细胞释放的TNF-α和IL-1β的含量。结果:1、(1)与Control组相比,HGHF组卫星胶质细胞P2X7R转录水平(P<0.01)和蛋白水平明显增加(P<0.001);与HGHF组相比,HGHF+P2X7 sh RNA组卫星胶质细胞P2X7R转录水平(P<0.01)和蛋白水平明显降低(P<0.001);(2)卫星胶质细胞P2X7R和GFAP共表达,HGHF组GFAP和P2X7R共表达程度最高(P<0.001),HGHF+P2X7 sh RNA组的共表达程度比HGHF组低(P<0.001)。2、(1)与Control组相比,和HGHF组卫星胶质细胞共培养后的神经元TRPV1转录水平(P<0.001)和蛋白水平明显增加(P<0.01),与HGHF+P2X7 sh RNA组卫星胶质细胞共培养后的神经元TRPV1转录水平(P<0.001)和蛋白水平明显降低(P<0.01);(2)神经元TRPV1和Neu N共表达,与HGHF组卫星胶质细胞共培养后的神经元TRPV1和Neu N共表达程度最高(P<0.01),与HGHF+P2X7 sh RNA组卫星胶质细胞共培养后的神经元共表达程度比HGHF组低(P<0.01)。3、(1)与Control组相比,HGHF组卫星胶质细胞中P-p38、P-p65蛋白表达量明显升高(P<0.001);与HGHF组相比,HGHF+P2X7 sh RNA组P-p38、P-p65蛋白表达量明显下降(P<0.01)。(2)与Control组相比,与HGHF组卫星胶质细胞共培养后的神经元PKC-?和P-p38蛋白表达明显增加(P<0.01);与HGHF组相比,与HGHF+P2X7 sh RNA组卫星胶质细胞共培养后的神经元PKC-?和P-p38蛋白表达明显降低(P<0.01)。4、(1)HGHF组卫星胶质细胞Ca2+含量高于Control组(P<0.001),而HGHF+P2X7 sh RNA组卫星胶质细胞Ca2+含量比HGHF组低(P<0.01);(2)与HGHF组卫星胶质细胞共培养后的神经元Ca2+含量高于Control组(P<0.01),与HGHF+P2X7 sh RNA组卫星胶质细胞共培养后的神经元Ca2+含量比HGHF组低(P<0.01)。5、(1)与Control组相比,HGHF组卫星胶质细胞中IL-1β(P<0.001)和TNF-α(P<0.01)蛋白表达量明显升高;与HGHF组相比,HGHF+P2X7sh RNA组IL-1β和TNF-α(P<0.01)蛋白表达量明显下降。(2)与Control组相比,HGHF组卫星胶质细胞释放炎性因子IL-1β和TNF-α明显增加(P<0.01);与HGHF组相比,HGHF+P2X7 sh RNA组卫星胶质细胞释放炎性因子IL-1β和TNF-α明显减少(P<0.01)。6、卫星胶质细胞在HGHF环境的诱导下GFAP的表达量升高(P<0.001),而用P2X7 sh RNA下调P2X7R后可减少HGHF诱导的GFAP表达的上升(P<0.01)。结论:HGHF可诱导SGCs的激活并增加炎症因子的释放,下调HGHF环境中SGCs的P2X7R可减少神经元TRPV1的表达;Ca2+/P38 MAPK/NF-κB信号通路可能涉及下调P2X7R减少SGCs中炎症因子释放过程,而Ca2+/PKC-?/P38MAPK信号通路可能涉及下调P2X7R抑制神经元TRPV1表达的病理生理过程。