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背景食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是东亚地区最常见的食管癌亚型,既往的流行病学调查研究显示食管鳞癌具有明显的暴露驱动致病因素,从而促进肿瘤转化的发生。除此之外,针对诸如河南林县等食管鳞癌高发地的家族聚集现象的研究揭示了促进食管鳞癌发生发展的相关基因突变及修饰的存在。患者就诊时往往已经发生远处转移,因此,食管鳞癌的预后往往较差。尽管在包括肿瘤切除、化疗、放疗和免疫治疗的食管鳞癌治疗方式领域已经取得了一些进步,但是患者的5年生存率仍然较低。因此,深入了解导致食管鳞癌发生发展的分子机制,识别相关信号通路下游靶点作为新的治疗靶点,并建立高效的临床预测模型成为医学临床基础研究刻不容缓的任务。ACTL6A是染色质重塑复合物SWI/SNF（又名BRG1/brm相关因子复合物）的一个重要的辅助亚基,其在PBAF、cBAF、ncBAF 3种类型的SWI/SNF复合物中均有存在。它既可作为该复合物的一个亚基与其它亚基在细胞信号通路的调节中发挥协同作用,从而参与到囊泡运输,纺锤体定位,核迁移和染色质重塑等一系列生理调节过程中,亦可以独立于该复合物对细胞的生理过程进行调节。在肿瘤中,ACTL6A可直接调控一系列与增殖分化相关的基因,如P21（Cip1）、Oct4、Sall4、Fgf4,通过影响上述基因的转录从而影响其表达。与肿瘤相关的研究显示ACTL6A在多种肿瘤组织中呈现显著的高表达,并呈现高度扩增的基因改变特征。然而目前尚未有研究阐明ACTL6A在食管鳞癌的发生发展过程中所发挥的作用。最近的一项基于癌症基因组图谱（TCGA,The Cancer Genome Atlas）数据集的生物信息学研究通过基因表达谱交互分析（GEPIA,Gene Expression Profiling Interactive Analysis）的方法进行了 KEGG分析和基因集富集分析（GSEA,gene set enrichment analysis）,结果表明ACTL6A的表达可能会影响核糖体通路。由于S6激酶（S6K1）是该通路的关键调节分子,参与到蛋白翻译调控的过程中,而且S6K1-pS6信号通路在生长因子调节细胞增殖和生存的过程中起到重要的信号中继作用,因此我们推测S6K1是ACTL6A下游的作用靶点。S6K1调节S6蛋白磷酸化的位点通常位于Ser235,Ser236,Ser240,Ser244和Ser247。在包括食管鳞癌在内的多种肿瘤中,S6K1的活性升高和S6磷酸化异常上调频繁出现。虽然磷酸化核糖体蛋白S6（pS6）被认为是ESCC的一个潜在靶点,且S6磷酸化在ESCC中具有预后意义,但S6与ACTL6A之间的确切调控关系尚不能确定。为了能从整体上认识ACTL6A对食管鳞癌细胞信号转导通路的调控,我们对ACTL6A敲减的食管鳞癌细胞系进行了转录组学测序分析（RNAseq）,并对该结果进行了基因表达定量分析、基因注释分析—KEGG注释和GO注释、差异基因分析、富集分析、蛋白网络互作分析和GSEA分析,然后将其在分子生物学实验中进行印证,发现ACTL6A对食管鳞癌信号转导通路的生物信息学分析结果与分子生物学实验结果具有高度吻合性。通过异体移植瘤模型验证了生物信息学和分子生物学实验的结果。方法1.采用基于TCGA数据库的GEPIA门户网站分析食管癌患者中ACTL6A的表达及其与患者生存状况的相关性。2.采用基于TCGA数据库的Oncomine平台分析不同病理组织类型的食管癌与癌旁正常组织中ACTL6A mRNA的表达情况;3.采用cBioPortal平台网站对TCGA数据库中185例食管癌ACTL6A基因的突变类型进行分析。4.采用基于TCGA数据库的Linked Omics平台网站对96例食管鳞癌患者ACTL6A mRNA表达水平与各临床病理学参数的相关性进行统计学分析。5.采用免疫组织化学（IHC）的方法对本中心128例食管鳞癌患者的肿瘤组织及相应癌旁正常食管黏膜组织中ACTL6A蛋白的表达水平进行检测,并对人食管鳞癌组织中ACTL6A蛋白的表达水平与患者临床病理学参数的相关性进行分析。6.Log-Rank法对食管鳞癌患者临床病理学特征进行单因素分析,COX 比例风险回归模型对食管鳞癌患者生存状况进行单因素与多因素分析,并通过决策曲线分析ACTL6A蛋白的表达水平对食管鳞癌患者预后的临床应用价值。7.采用免疫组织化学法（IHC）对本中心128例食管鳞癌患者的肿瘤组织及相应癌旁正常食管黏膜组织中pS6蛋白的表达水平进行检测,并分析其与ACTL6A蛋白表达的相关性。8.实时定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测ACTL6A基因在TE7,KYSE510,KYSE150,KYSE450,EC1,EC9706,EC109 七种食管鳞癌细胞系中的 mRNA和蛋白表达水平。9.选择ACTL6A表达水平最低的TE7细胞经慢病毒转染构建ACTL6A过表达的稳转株,选择ACTL6A表达水平最高的EC1细胞经慢病毒转染构建ACTL6A敲减的稳转株。10.CCK8法和EdU法检测ACTL6A过表达的TE7细胞系（TE7 ACTL6A）相对于其空白对照组（TE7 CON）增殖活力的改变,同时检测ACTL6A敲减组（EC1 shACTL6A-1、EC1 shACTL6A-2）相对于其无义序列对照组（EC1 shCON）的增殖活力的改变。11.流式细胞术检测ACTL6A表达水平的变化对于TE7和EC1细胞周期进程及凋亡的影响。12.蛋白免疫印迹实验检测ACTL6A对食管鳞癌细胞的周期相关蛋白及核糖体通路相关蛋白表达的影响,并采用基于TCGA数据库食管鳞癌样本信息的Linked Omics平台对ACTL6A的表达与周期相关蛋白表达的相关性分析进行分析。13.LY-2584702甲苯磺酸盐阻断S6K1或siS6干扰S6的表达,通过CCK8和EdU检测ACTL6A过表达的TE7细胞的增殖活力的变化,并通过蛋白免疫印迹实验探究其分子基础。14.构建了 ACTL6A基因干扰的食管癌细胞系EC1稳转株,将shCON及shACTL6A-2各三株送至北京贝瑞和康测序中心,委托其进行转录组学测序及功能和通路的富集分析。15.蛋白免疫印迹实验检测ACTL6A的表达对食管鳞癌细胞系AKT/mTOR/pS6通路关键分子表达的影响,并检测AKT抑制剂或mTOR抑制剂对ACTL6A过表达食管鳞癌细胞的AKT/mTOR/pS6通路关键分子的影响。16.分别构建 TE7 Lv-CON、TE7 Lv-ACTL6A、EC1 Lv-shACTL6A-1、EC1 Lv-shCON的Balb/c-nu鼠异体移植瘤模型。每天测量异体移植瘤的体积,并绘制生长曲线。17.处死各组负瘤Balb/c-nu鼠,取瘤称重。将各组肿瘤组织进行石蜡包埋及液氮冻存,通过切片进行HE染色观察各组肿瘤组织形态,通过免疫组织化学染色和蛋白免疫印迹实验检测细胞周期相关蛋白CDK2和cyclin D1,AKT/mTOR/S6K1的关键分子S6K1和pS6,以及增殖相关蛋白Ki67的表达水平。结果1.GEPIA网站分析结果显示ACTL6A基因在182例患者食管癌组织中的表达显著高于286例正常食管黏膜组织（P＜0.01）。而且,ACTL6A基因在宫颈癌（cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma,CESC）、头颈鳞癌（head and Neck squamous cell carcinoma,HNSC）、肺鳞癌（lung squamous cell carcinoma,LUSC）的表达均显著高于相应正常组织（P＜0.01）。2.Oncomine平台的分析结果显示ACTL6A mRNA在食管鳞癌中的表达水平均显著高于正常食管黏膜（P＜0.0001）,在正常食管黏膜组织、Barrett食管黏膜组织及食管腺癌组织中的表达呈现上升的趋势。3.Linked Omics数据库对96例食管鳞癌患者ACTL6A mRNA的表达水平与各临床病理学参数的相关性统计学分析结果显示,ACTL6A mRNA在晚期食管鳞癌（Ⅲ期和Ⅳ期）中的表达水平显著高于早期食管鳞癌（Ⅰ期和Ⅱ期）;而且,ACTL6A mRNA在不同种族的食管鳞癌中的表达差异表现为在亚裔中的表达水平显著高于非洲裔和欧美裔。然而,ACTL6A mRNA的表达与食管鳞癌的浸润深度、淋巴结转移数目和是否发生远处转移的相关性并不显著。4.cBioportal网站的分析结果显示ACTL6A在食管癌中的拷贝数变化主要由基因扩增引起,且与其mRNA的表达水平升高密切相关。5.采用免疫组织化学法（IHC）对本中心128例食管鳞癌患者的肿瘤组织及相应癌旁正常食管黏膜组织中ACTL6A蛋白的表达水平进行检测,结果显示ACTL6A蛋白在食管鳞癌组织中的表达显著高于其在癌旁正常食管黏膜组织中的表达（x2=64.8,P＜0.001）,ACTL6A蛋白的表达水平与患者的肿瘤大小、分化程度、浸润深度、TNM分级及肿瘤原发病灶的部位显著相关。6.Log-Rank法对128例食管鳞癌患者的临床病理学参数与患者总生存期（OS）相关性的单因素分析结果显示:肿瘤大小、浸润深度、TNM分期及ACTL6A蛋白在食管鳞癌组织中的表达程度均与患者的总生存期相关,所绘制的Kaplan-Meier生存曲线表明ACTL6A蛋白在食管鳞癌中的表达水平越高,患者的预后越差;COX单因素比例风险回归模型分析结果显示:肿瘤大小、浸润深度、TNM分级和ACTL6A蛋白在肿瘤组织中的表达水平可对食管鳞癌患者的生存状况产生影响。进一步将影响患者预后的COX单因素纳入COX多因素分析,结果显示ACTL6A蛋白在肿瘤组织中的表达水平是食管鳞癌患者的独立预后因素。.7.决策曲线法分析ACTL6A蛋白的表达水平对食管鳞癌患者预后的临床应用价值结果显示包含ACTL6A蛋白表达水平数据的临床预后模型的预后效能显著提高。8.采用免疫组织化学法（IHC）对本中心128例食管鳞癌患者的肿瘤组织及相应癌旁正常食管黏膜组织中pS6蛋白的表达水平进行检测,结果显示pS6蛋白在食管鳞癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常食管黏膜组织（P＜0.05）,且与ACTL6A在食管鳞癌中的表达水平呈正相关（P＜0.01）。9.ACTL6A基因在7种食管鳞癌细胞系中的mRNA及蛋白水平的表达水平高低的趋势基本一致,在TE7细胞中的表达水平最低,而在EC1细胞中的表达水平最高。10.CCK8增殖实验结果显示,与对照组细胞相比,转染Lv-shACTL6A-1和Lv-shACTL6A-2的EC1细胞生长受到抑制,而过表达ACTL6A可促进TE7细胞的生长。11.EdU增殖实验结果显示,与对照组细胞相比,过表达ACTL6A基因的TE7细胞中的EdU阳性细胞比例显著增加（P＜0.05）,而ACTL6A基因表达下调的EC1细胞中EdU阳性细胞的比例均下降（P＜0.05）。12.流式细胞术检测细胞周期分布的结果显示,与对照组EC1细胞相比,Lv-shACTL6A-1和Lv-shACTL6A-2转导的EC1细胞G1期细胞比例显著增加（P＜0.01）,S期细胞比例显著降低（P＜0.05）,M期细胞比例并无显著变化;而与空载慢病毒转导的TE7细胞相比,Lv-ACTL6A转导的TE7细胞G1期细胞比例显著降低（P＜0.05）,S期和G2/M期细胞的比例均显著增加（P＜0.05）。13.流式细胞术检测细胞凋亡的结果显示,转导了 Lv-CON、Lv-ACTL6A的 TE7 细胞和转导了 Lv-shCON、Lv-shACTL6A-1、Lv-shACTL6A-2 的 EC1 细胞中,各实验组细胞与对照组相比,凋亡程度并无显著差异。14.通过免疫印迹实验检测了与G1期相关周期蛋白的表达,结果显示,在EC1细胞中抑制ACTL6A基因的表达可导致G1期阻滞,并伴有细胞周期相关蛋白cyclin D1和CDK2的下调,细胞周期负性调控因子p27和p21的上调,而在TE7细胞中过表达ACTL6A基因可导致细胞周期相关蛋cyclin D1和CDK2的上调,细胞周期负性调控因子p27和p21下调。ACTL6A表达的上调可引起S6K1表达水平及S6蛋白磷酸化水平的升高,然而,S6蛋白的表达水平并不会受到影响;而过表达ACTL6A基因可导致细胞周期相关蛋白和S6磷酸化水平与前述敲减ACTL6A基因相反的变化趋势。15.Linked Omics网站对食管鳞癌患者中ACTL6A基因和细胞周期相关基因的相关性进行分析,结果显示,ACTL6A与细胞周期相关基因CDKN1A（p21）、CDK2、CCND1（Cyclin D1）存在显著的相关性（P＜0.05）。16.LY-2584702甲苯磺酸盐或siS6可以削弱ACTL6A过表达对食管鳞癌细胞的促增殖作用,采用LY-2584702甲苯磺酸盐抑制S6磷酸化的上游激酶S6K1,可产生与S6敲减相似的回复效应。蛋白免疫印迹实验验证了该回复效应的分子基础,即无论是敲减S6,还是抑制S6K1,均可使ACTL6A过表达引起的cyclin D1及CDK2表达升高的效应减弱,同时也可使ACTL6A过表达引起的p21及p27的表达降低的程度减轻。17.EC1 shCON及EC1 shACTL6A-2的转录组学测序及功能和通路的富集分析结果显示,ACTL6A基因的敲减共导致646个基因发生差异性表达,其中,293个基因的表达显著上调,353个基因的表达显著下调。在KEGG通路富集结果显示PI3K/AKT通路受ACTL6A基因表达水平的影响最显著。18.提取ACTL6A过表达组及对照组的TE7细胞蛋白,蛋白免疫印迹实验分析显示,TE7中过表达ACTL6A可使pAKT、pS6蛋白水平显著升高;与对照组的EC1细胞中,敲减ACTL6A可使pAKT、pS6蛋白水平显著降低。19.采用AKT抑制剂与mTOR抑制剂处理ACTL6A过表达的食管鳞癌细胞系TE7,结果显示,AKT抑制剂可显著抑制AKT蛋白的表达,同时显著回复ACTL6A过表达所引起的pAKT和pS6蛋白水平的升高,而mTOR抑制剂可显著抑制mTOR蛋白的表达,同时显著回复ACTL6A过表达所引起的pS6蛋白水平的升高。20.TE7 ACTL6A过表达组的BALB/c-nu鼠异体移植瘤的生长速度与TE7 CON对照组相比显著增快（P＜0.05）,而EC1 shACTL6A-1敲减组的BALB/c-nu鼠异体移植瘤的生长速度与EC1 shCON对照组相比显著减慢（P＜0.05）。21.过表达ACTL6A的TE7细胞的异体移植瘤的终重量显著高于其空白对照组TE7 CON的异体移植瘤（P＜0.05）,而ACTL6A敲减的EC1细胞,即EC1 ACTL6A-1,异体移植瘤的终重量显著低于其无义对照组EC1 shCON的异体移植瘤（P＜0.05）。22.蛋白免疫印迹和免疫组织化学法检测各组移植瘤中关键信号传导分子在蛋白水平的表达,结果显示,ACTL6A的过表达可以在体内环境中显著促进细胞周期相关蛋白CDK2和cyclin D1的表达,而AKT/mTOR/S6K1的关键分子S6K1和pS6的蛋白表达水平也显著升高,同时可使增殖相关蛋白Ki67的表达水平显著升高;ACTL6A被敲减后可以抑制细胞周期相关蛋白CDK2和cyclin D1,以及AKT/mTOR/S6K1的关键分子S6K1和pS6的蛋白表达,,同时可使增殖相关蛋白Ki67的表达水平显著降低。结论1.ACTL6A蛋白在人食管鳞癌组织中呈高表达,并提示食管鳞癌患者具有差的预后。2.ACTL6A具有促进食管鳞癌细胞增殖的作用,并影响食管鳞癌细胞从G1期向S期的过渡。3.ACTL6A可通过对其下游AKT/mTOR/S6K1/S6/pS6通路的调节而对食管鳞癌细胞的增殖能力产生影响。