【摘 要】
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目的:研究舒肝颗粒针对肝纤维化防治作用的机制。为了探讨舒肝颗粒对肝纤维化(HF)的逆转是否有作用,我们采用舒肝颗粒作用于体外培养的大鼠肝星状细胞(HSC),研究其对HSCα-平滑肌动蛋白(Smooth muscle actin,α-SMA)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1
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目的:研究舒肝颗粒针对肝纤维化防治作用的机制。为了探讨舒肝颗粒对肝纤维化(HF)的逆转是否有作用,我们采用舒肝颗粒作用于体外培养的大鼠肝星状细胞(HSC),研究其对HSCα-平滑肌动蛋白(Smooth muscle actin,α-SMA)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达的影响,以探讨舒肝颗粒对HSC增殖与活化的影响及相关机制,为舒肝颗粒临床应用提供进一步理论依据。
方法:将肝星状细胞培养于含10%特级胎牛血清的RPMI1640培养基,37℃、5%CO2孵箱中培养。采用MTT法测舒肝颗粒不同浓度组(0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.08mg/ml)对细胞增殖情况的影响,根据结果将后续试验分组为空白对照组、舒肝颗粒0.01mg/ml组、舒肝颗粒0.02mg/ml组和肝颗粒0.04mg/ml组,干预体外培养的HSC24小时后,镜下观察各组细胞形态,用免疫组化法测定各组HSCα-SMA表达情况,用放射免疫法测定各组HSC TNF-α表达情况,用荧光定量PCR法测定各组HSC TGF-β1表达情况。
结果:1.舒肝颗粒四个浓度组的MTTOD值均低于空白对照组,0.01mg/ml与空白对照组之间HSC增殖差异无显著性意义(P>0.05),其余各组与空白对照组之间HSC增殖差异有显著性意义(P<0.05)。2.镜下观察四组细胞:空白对照组HSC胞体扁平,伸展成膜状,呈肌成纤维细胞的改变;舒肝颗粒0.01mg/ml组,胞体伸展稍被抑制,胞体呈星形;舒肝颗粒0.02mg/ml组,HSC细胞形态介于舒肝颗粒0.01mg/ml组与舒肝颗粒0.04mg/ml组之间;舒肝颗粒0.04mg/ml组,能明显抑制细胞体伸展,胞体近梭形,类似于静止期形态。各组均未见核固缩或凋亡现象。3.免疫组化法检测各组α-SMA表达情况:α-SMA在各组均有表达,采用计算机图像分析系统免疫组织化学图像分析软件,所取参数为阳性细胞数计数比率。阳性信号为棕黄色或棕褐色,位于细胞浆的线粒体膜、内质网膜上,阴性组织呈现蓝色。同一盖玻片,取200×高倍视野下α-SMA显色摄取图像,用细胞计数软件作定量分析代表阳性细胞计数比率。空白对照组、舒肝颗粒0.01mg/ml组、舒肝颗粒0.02mg/ml组及舒肝颗粒0.04mg/ml组阳性表达率用均数±标准差表示分别为(62.83±3.42)%、(47.31±2.74)%、(37.79±3.01)%、(25.74±2.83)%,各组与空白对照组相比较差异有统计学意义(P<0.01)。4.放射免疫法测各组TNF-α水平结果显示:空白对照组、舒肝颗粒0.01mg/ml组、舒肝颗粒0.02mg/ml组和肝颗粒0.04mg/ml组TNF-α含量用均数±标准差表示分别为:(2.44±0.54)ng/ml、(2.13±0.35)ng/ml、(1.92±0.33)ng/ml和(1.37±0.35)ng/ml,空白对照组与舒肝颗粒0.01mg/ml组两组差异无统计学意义(P>0.05),空白对照组与舒肝颗粒0.02mg/ml组、0.04mg/ml组组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。5.荧光定量PCR法测各组TGF-β1的表达情况:空白对照组、舒肝颗粒0.01mg/ml组、舒肝颗粒0.02mg/ml组及舒肝颗粒0.04mg/ml组TGF-β1表达水平通过计算2-△△Ct值用均数±标准差表示分别为:(1.00±0.09)、(0.71±0.08)、(0.55±0.07)、(0.44±0.03),且组间差异有统计学意义(P<0.01)。
结论:1.舒肝颗粒可能通过抑制HSC增殖而起到抗纤维化作用,且抑制程度与药物剂量呈一定依赖关系。2.舒肝颗粒可抑制HSC活化,对α-SMA的蛋白表达有明显抑制作用。3.舒肝颗粒可抑制HSC TNF-α表达。4.舒肝颗粒可抑制HSC TGF-β1表达。
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