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目的:创伤后应激障碍（post traumatic stress disorder,PTSD）,是由于遭受重大事故、灾难等引起的长期持续性的精神障碍或焦虑综合症,其临床表现的核心特征是记忆异常。国内外PTSD研究发现,磁共振成像（magnetic resonance imaging,MRI）检查时PTSD患者海马区体积缩小,推测PTSD患者记忆异常可能与海马萎缩有关。海马为调节认知功能的关键部位,创伤的应激很可能会导致海马体中的细胞凋亡,并通过尚未完全确定的机制发展为PTSD。PTSD的生物学机制之一涉及基础细胞生物学的失调。内质网是一种多功能的信号细胞器,负责蛋白质折叠和组装、钙存储、脂质和固醇的生物合成以及细胞凋亡等广泛的细胞过程。各种药理、病理生理和环境刺激可对内质网施加压力,进而中断内质网中的蛋白质折叠过程,这种情况称为内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）。为了应对ERS,还会出现未折叠蛋白反应（unfolded protein reaction,UPR）。UPR的主要功能是恢复内质网稳态,帮助细胞适应ERS。然而,当ERS时间延长或ERS程度过大时,UPR信号可以通过激活应激诱导的促凋亡因子来启动程序性细胞凋亡。UPR通路的失调或过度激活,在心血管疾病、代谢疾病、神经退行性疾病和癌症等多种危及生命的疾病的发生和发展中起着至关重要的作用。据报道,ERS可诱导细胞凋亡。当细胞经历ERS时,UPR被启动以应对ERS的影响。在诱发ERS过程中活化转录因子6（Activating transcription factor 6,ATF6）通路发挥了关键作用。ATF6,是一种内质网相关的II型跨膜蛋白,有三个结构域:管腔C末端、跨膜和细胞质N末端结构域。ATF6有两种亚型:ATF6α和ATF6β。ATF6通路在正常条件下,ATF6α主要以酶原形式（p90ATF6α）存在,与内质网伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78,GRP78）紧密结合。ERS状况下,ATF6α会和GRP78解离至高尔基体,先后被位点蛋白酶1（Site 1 Protease,S1P）和位点蛋白酶2（Site 2 Protease,S2P）水解释放出一个约50 k Da的片段,即p50ATF6α片段。p50ATF6α片段可进一步移位到细胞核内,作用于ERS相关基因的转录与表达,如GRP78和钙网膜蛋白等伴侣蛋白以及CCAAT增强子结合蛋白的同源蛋白（CCAAT enhancer binding protein-homologous protein,CHOP）等。文献报道,PTSD也可能诱发ERS反应。动物实验研究表明,单次持续应激（single prolonged stress,SPS）可引起PTSD大鼠海马和前额叶皮质GRP78、Caspase-12表达水平的改变,提示ERS可能参与了PTSD诱导的细胞凋亡,海马神经元凋亡可能是PTSD大鼠记忆障碍的病理机制之一。然而ERS通过PRKR样内质网激酶（Prkr like endoplasmic reticulum kinase,PERK）、肌醇需酶1α（Inositol-requiring enzyme-1α,IRE1α）、ATF6三条通路可以介导细胞凋亡,PTSD患者海马神经元的凋亡是否主要通过ATF6发挥重要作用还需进一步探讨,本实验将使用ATF6通路抑制剂4-（2-氨乙基）苯磺酰氟盐酸盐（4-（2-Aminoethyl）benzenesulfonyl fluoride hydrochloride,AEBSF）抑制ATF6的表达,进而观察PTSD大鼠海马神经元凋亡的变化。莱菔硫烷（sulforaphane,SFN）具有抗氧化等功能的小分子化合物。有研究表明:长期食用含有SFN的食物可降低神经退行性病变的发病率。本研究预测通过SFN治疗PTSD大鼠有可能抑制PTSD所致的应激反应进而抑制海马神经元的凋亡,可起到对PTSD海马神经元的保护作用。为SFN有望成有效治疗PTSD的靶点药物提供理论基础。本研究旨在通过SPS建立PTSD大鼠模型。通过行为学实验检测SPS大鼠的焦虑及学习记忆能力。采用免疫组化、TUNEL染色、western blotting及实时定量逆转录聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR）等方法研究ATF6/S1P/S2P信号通路在PTSD大鼠海马的表达改变以及对海马神经元凋亡的影响,阐明ATF6/S1P/S2P信号参与PTSD的记忆异常的分子机制。研究方法:1.实验动物分组:将300只Wistar大鼠随机分为12组,实验分成3部分:（1）正常对照组（Control组）（25只）、SPS 1d组（15只）、SPS 7d组（25只）、SPS 14d组（15只）。（2）正常对照（Control）组、SPS 7d组、SPS 7d+AEBSF组、Control+AEBSF组,每组30只。AEBSF为ATF6通路抑制剂。（3）正常对照（Control）组、SPS 7d组、SPS 7d+SFN组、Control+SFN组,每组25只。2.SPS方法建立大鼠PTSD模型。3.行为学测定:通过行为学实验Morris水迷宫（Morris water maze,MWM）及旷场实验检测各组大鼠空间学习记忆能力和焦虑程度。4.TUNEL染色检测各组大鼠海马神经元凋亡。5.免疫组织化学染色:检测ATF6α、GRP78、CHOP在各组大鼠海马表达情况。6.Western blotting技术:采用Western blotting方法检测ATF6α、GRP78、S1P、S2P、CHOP、Caspase-12蛋白在各组大鼠海马的表达变化。7.qRT-PCR技术:采用qRT-PCR方法检测各组大鼠海马ATF6α、GRP78、S1P、S2P、CHOP、Caspase-12 m RNA的表达变化。结果:1.行为学:MWM实验:SPS刺激后第1到5天,SPS 7d组大鼠平均逃避潜伏期明显高于Control组;SPS 7d组大鼠在目标象限停留的时间百分比明显低于Control组;旷场实验:SPS 7d组大鼠进入中心区域的次数和中心区域运动距离百分比明显低于Control组。TUNEL染色:与Control相比,凋亡阳性细胞数目和细胞凋亡率在SPS 1d组有所增加,在SPS 7d组明显增加,达到高峰,在SPS 14d组下降有所降低。免疫组织化学染色显示:与Control组相比,经SPS刺激后第1天,ATF6α、GRP78阳性表达有所增多;经SPS刺激后第7天,ATF6α、GRP78阳性表达显著增多;与SPS 7d组相比,ATF6α、GRP78阳性在第14天表达减少。Western blotting检测各组大鼠海马中ATF6α、GRP78蛋白水平,qRT-PCR检测各组大鼠海马神经元中ATF6αm RNA、GRP78 m RNA表达,其结果变化趋势与免疫组化相似。2.MWM定位航行实验结果显示,与SPS 7d组相比,SPS 7d+AEBSF组大鼠平均逃避潜伏期明显降低;空间探索实验分析结果显示,与SPS 7d组相比,SPS 7d+AEBSF组大鼠在目标象限停留的时间百分比明显增加。旷场实验结果显示,与SPS 7d组相比,SPS 7d+AEBSF组大鼠进入中心区域的次数和中心区域运动距离百分比明显增加。TUNEL:与SPS 7d组相比,SPS 7d+AEBSF组的细胞凋亡率明显下降。免疫组织化学染色结果显示:对SPS 7d的大鼠给予AEBSF预处理后,CHOP表达明显减少;而对正常大鼠给予AEBSF预处理后,对CHOP表达无明显影响。采用Western blotting检测各组大鼠海马中ATF6α、S1P、S2P、CHOP和Caspase-12蛋白水平进行检测。结果显示,对SPS 7d的大鼠给予AEBSF预处理后,p90ATF6α、p50ATF6α、S1P、S2P、CHOP和Caspase-12水平明显减少;而对正常大鼠给予AEBSF预处理后,对ATF6通路无明显影响。qRT-PCR检测结果显示,对SPS 7d大鼠给予AEBSF预处理后,ATF6α、S1P、S2P、CHOP、Caspase-12 m RNA表达明显减少;而对正常大鼠给予AEBSF预处理后,对ATF6α通路无明显影响。这与Western blotting检测结果相一致。3.MWM定位航行实验结果显示,与SPS 7d组相比,SPS 7d+SFN组大鼠平均逃避潜伏期明显降低;空间探索实验分析结果显示,与SPS 7d组相比,SPS 7d+SFN组大鼠在目标象限停留的时间百分比明显增加。旷场实验结果显示,与SPS 7d组相比,SPS 7d+SFN组大鼠进入中心区域的次数和中心区域运动距离百分比明显增加。TUNEL染色结果显示,与SPS 7d组相比,SPS 7d+SFN组的细胞凋亡率明显下降。Western blotting对海马中ATF6α、S1P、S2P、CHOP和Caspase-12蛋白水平进行了检测。结果显示,对SPS 7d大鼠给予SFN预处理后,p90ATF6α、p50ATF6α、S1P、S2P、CHOP和Caspase-12水平明显减少;而对正常大鼠给予SFN预处理后,对ATF6α通路无明显影响。qRT-PCR检测结果显示,对SPS 7d大鼠给予SFN预处理后,ATF6α、S1P、S2P、CHOP、Caspase-12 m RNA表达明显减少;而对正常大鼠给予SFN预处理后,对ATF6α通路无明显影响。这与Western blotting检测结果相一致。结论:1.SPS引起PTSD大鼠海马神经元内的内质网应激,激活了ATF6通路,促进了细胞凋亡途径,影响PTSD大鼠的记忆异常。2.AEBSF通过抑制ATF6信号通路,抑制海马神经元凋亡,改善PTSD大鼠的学习记忆能力和焦虑状态。3.SFN可抑制ATF6信号通路,抑制海马神经元的凋亡,改善PTSD大鼠的学习记忆能力和焦虑状态,对PTSD大鼠的治疗起到重要作用。