目的:疟疾是世界上最常见的寄生虫病,是热带地区普遍存在的传染病,严重威胁人类健康,给全球的公共卫生造成巨大负担。顺应疾病特点的抗疟措施诸如使用杀虫剂处理过的蚊帐、室内喷洒杀虫剂和青蒿素联合疗法等在过去的十几年曾共同促成了疟疾发病率和死亡率的显着下降,根据2019年WHO的世界疟疾报告,2018年全球共有2.28亿疟疾患者,死亡人数降至40.5万人。但是随着COVID-19新型冠状病毒的全球流行,很多疟疾防控措施被迫中断,WHO在2021的世界疟疾报告中指出2020年疟疾在85个国家流行,全球的疟疾感染病例升高至2.41亿人,死亡人数也达到62.7万人。全球疟疾战略中计划于2020年至少在21个国家实现本土疟疾病例清零的里程碑没有达到,而且如果不能采取强有力的行动,要2030年大范围控制和消除疟疾的目标也将无法实现。除了新冠疫情的影响外,耐药疟原虫和抗药蚊子的出现及缺乏有效的抗疟疫苗也对疟疾的防控提出了巨大挑战,疟疾的预防和治疗仍然是被广泛关注的科学难题之一。疟疾根除研究议程（mal ERA）强调了疫苗对于控制疟疾传播具有重要意义,将其列为消除疟疾的最佳武器之一。针对疟原虫生活史研制的疟疾疫苗主要分三大类:红前期疫苗、红内期疫苗以及传播阻断疫苗（Transmission-blocking vaccines,TBVs）。红前期疫苗与红内期疫苗可降低疟疾的发病率与感染率,但是因为这两种疫苗均暴露于人体的免疫系统中,对宿主免疫逃逸/免疫抑制效应明显并且存在相对广泛的基因多态性,存在弱点。TBVs是指利用疟原虫有性阶段或蚊阶段的表面抗原免疫个体,诱导产生的抗体可以阻止疟原虫在蚊体内的后续发育,从而彻底的切断疟疾的传播。TBVs因为可以诱导群体的免疫,并且不受人类宿主免疫系统选择压力的影响而具有优势。然而,虽然科研人员投入了大量的努力,目前尚未研制出可以在临床中应用的有效TBVs,并且很多在动物模型中筛选出的TBVs候选抗原最终在人体内难以产生有效的免疫反应性,故新型TBVs的开发和研究迫在眉睫。在引起人类疟疾感染的五种疟原虫中,恶性疟疟原虫和间日疟原虫是最常见的类型,其中间日疟原虫感染传播范围广泛,给亚洲和美洲地区造成巨大的卫生负担。间日疟原虫的无症状感染者亦能通过蚊子造成疾病传播,间日疟原虫的休眠体可以潜伏在患者肝脏,从而逃避抗疟药物的杀伤并且可起疾病的复发,这些因素让控制间日疟的传播有着更大的难度。因为间日疟原虫缺乏可靠的体外培养方法,加上实验条件和伦理等因素的限制,间日疟TBVs的开发进展严重滞后,目前进入临床研究阶段的间日疟TBVs基本均来源于恶性疟疫苗候选抗原的同系物,亟需开发新型有效的间日疟TBVs候选抗原。研制新型间日疟TBVs的核心任务是寻找能够阻断疟原虫有性阶段传播和发育效应的抗原。良好疫苗候选抗原应该具备以下特性:（1）它们应该位于细胞表面以增加其对免疫系统监视的可及性,（2）它们必须具有抗原性,（3）它们存在一个或数个跨膜区域来促进表达,（4）它们在不同种属的疟原虫中间应该为保守序列,以及（5）它们必须是非致敏性的。此外,对于间日疟原虫生命周期可能起到重要作用的关键抗原被认为是开发疫苗的优质靶点。近年来,随着疟原虫基因组的确定和多项转录组学、蛋白组学的研究取得了进展,反向疫苗学成为了开发新型TBVs的重要策略。反向疫苗学的具体思路是指在疟原虫全基因组中进行候选抗原的筛选,对于阶段特异性的、符合疫苗蛋白结构要求的、影响寄生虫生命周期的相关抗原进行克隆、表达并纯化出重组蛋白,然后在实验动物中研究重组蛋白的免疫保护作用,再挑选具备良好免疫反应性的抗原运用于临床标本中进行疫苗功能的研究。反向疫苗学更加高效并且有针对性,将是未来疟疾疫苗研究的主要方向。鉴于间日疟TBVs开发的重要意义和获取新型疫苗候选抗原的急迫性,本课题组拟运用反向疫苗学的思路,在疟原虫全基因组中筛选新型间日疟TBVs候选抗原。首先在疟原虫Plasmo DB数据库中查找在间日疟有性阶段（配子体期和动合子期）高水平转录的,符合疫苗结构要求的关键抗原,选择合适的异源表达系统获得重组蛋白并验证其免疫反应性,最后应用间日疟感染者的血液标本,对有潜力的抗原进行传播阻断能力的评估并分析候选抗原的基因多态性,鉴定出新型TBVs候选抗原。基于以上思路,本课题将通过间日疟新型TBVs候选抗原的筛选,表达和传播阻断功能评估,为抗击间日疟提供新的理论和实验依据。材料与方法:1.候选蛋白的筛选和预测。根据疟原虫TBVs的基本特征检索数据库Plasmo DB,设置检索策略:在配子体期/动合子期高水平转录,转录百分比大于98%;存在信号肽;存在跨膜区。然后进一步设置限定条件,预测候选蛋白的编码基因是否为可能影响有性阶段重要转录因子转录的关键基因。应用Clustal W进行同源性分析,应用MAGA5进行进化树分析,评价候选蛋白的保守性。在Plasmo DB数据库中下载候选蛋白的氨基酸序列,预测候选蛋白的一级、二级和三级蛋白质结构。用软件Tm Hmm2.0分析目标蛋白的跨膜区,应用Kolaskar and Tongaonkar预测的方法进行抗原决定簇分析。截取富含优势表位的氨基酸片段为候选蛋白重组表达的片段。通过蛋白质生物信息学网站,预测候选蛋白重组表达片段的磷酸化,糖基化位点和二硫键情况,同时评价其是否为易过敏性蛋白。2.重组蛋白的表达与纯化。应用碱基合成的方法获得编码重组蛋白的基因片段,将目的基因连接到p PIC9K质粒中获得重组质粒。应用电转染的方法,将重组质粒电转至毕氏酵母菌GS115中,通过菌落PCR鉴定出转染阳性菌。应用酵母培养基培养阳性菌株,然后利用甲醇诱导表达重组蛋白,用Ni-NTA His·Bind Superflow纯化重组蛋白,将得到的重组蛋白梯度透析后进行SDS-PAGE检测。同时表达了一种谷胱甘肽S-转移酶（GST）蛋白作为阴性对照。3.实验动物免疫及血清采集。6-8周龄BALB/c雌性小鼠（n=10）,皮下注射与弗氏完全佐剂混合的重组蛋白或GST蛋白,在初次免疫后14天和28天,再次皮下注射与弗氏不完全佐剂混合的重组蛋白或GST蛋白作为加强免疫。在末次免疫后10天,收集小鼠血清。4.重组蛋白免疫反应性的研究。应用收集到的重组蛋白小鼠抗血清作为一抗,对重组蛋白进行Western-blot检测,评价重组蛋白的免疫原性。用Elisa的方法检测重组蛋白免疫小鼠血清中的特异性抗体的滴度,评价重组蛋白的抗原性。5.间日疟原虫感染者血液标本的收集。人体实验方案获得泰国曼谷Mahidol大学伦理委员会批准,于2018年夏季采集泰国Tak省的间日疟感染者血液样本并进行后续实验。符合纳入本研究患者的条件有:有间日疟临床症状,血涂片可见间日疟原虫、年龄≥18岁,非妊娠患者。所有患者均自愿签署知情同意书,在开始抗疟疾治疗之前,采集患者静脉血5-10 m L并立即肝素化,得到间日疟感染者血液标本。6.纯化含有间日疟原虫配子体的红细胞。将收集到的间日疟感染者的血液加入浓度为47%Nycodenz与RPMI 1640培养基混合液中,颠倒混匀,500g离心25分钟。离心后混合液中间灰色界面处可以得到含有间日疟配子体感染的红细胞。7.IFA检测重组蛋白的天然抗原性。取纯化的富含间日疟配子体的红细胞制作薄层血涂片。将血涂片固定、封闭后加入重组蛋白抗血清孵育,再加入FITC标记的羊抗鼠Ig G（1:500稀释）孵育,应用DAPI染色,封片后应用荧光显微镜观察结果。8.直接膜饲喂养实验（DMFA）评估重组蛋白抗血清的传播阻断功能。用泰国血型为AB+健康志愿者的血清稀释重组蛋白r PvPH、r Pv SOP26或对照蛋白GST免疫小鼠抗血清,然后与间日疟患者的红细胞以1:1体积混合并在37℃条件下孵育15 min。将孵育后的血液样本放入玻璃喂食器中保持在37℃,允许100只饥饿的蚊子吸食喂食器中的血液混合物30分钟。在休息6小时后,挑选出充分吸血蚊子,用10%的蔗糖溶液在温度20℃,湿度80%的环境里喂养1周,并第7天随机解剖各组蚊子中的20个,检查蚊中肠上的卵囊数与感染的蚊子的数量。9.间日疟原虫DNA标本的收集。对于确诊间日疟感染的患者,取指尖血点到Whatman滤纸上,干燥后应用压缩塑料袋存储,后续应用血液DNA提取试剂盒提取间日疟原虫的DNA。10.候选蛋白的基因多态性分析。根据间日疟原虫Sal-1序列设计编码候选蛋白基因序列的PCR引物,并通过碱基合成的方式获得引物。以在泰国间日疟流行区提取的间日疟原虫DNA为模板,对相应基因片段进行扩增。应用试剂盒提取扩增的DNA,测序后应用Bio Edit软件,将扩增得到的序列与Sal-1序列进行同源比对,分析候选蛋白的基因多态性。11.统计分析。相关数据用SPSS 2.0进行计算。抗体滴度比较采用Student’s t检验;感染强度的比较采用Mann-Whitney U检验。感染率比较采用Fisher确切概率法。P＜0.05表示差异有统计学意义。结果:1.疫苗候选蛋白的筛选和生物信息学分析。在间日疟原虫全基因组中最终预测出两个间日疟TBVs候选蛋白:PVX＿098655和PVX＿101120,将其分别命名为PvPH和Pv SOP26。预测它们符合间日疟原虫TBVs的基本特点,即有性阶段转录,存在跨膜区和信号肽,在疟原虫不同种属之间保守。同时预测出表达这两个候选蛋白的基因,pvph和pvsop26,能够影响有性阶段功能性关键转录因子的转录水平,为间日疟原虫有性阶段的关键基因。经过蛋白质结构、亚细胞定位和抗原决定簇的预测,推断出PvPH和Pv SOP26符合疫苗候选蛋白的结构特点。它们均含有一个N端的信号肽,并且含有数个跨膜区。排除信号肽后,综合参照了抗原表位等因素最终选择了PvPH氨基酸序列中的22-304aa,和Pv SOP26中的30-272aa作为候选蛋白的重组蛋白表达片段。r PvPH和r Pv SOP26预测的分子量大小分别为32k Da为29k Da。对于重组蛋白转录后翻译修饰和折叠特点的预测表明r PvPH和r PvPH含有多个磷酸化和糖基化位点,均被预测为非过敏性蛋白。r PvPH中含有二硫键。2.重组候选蛋白的表达与鉴定。成功构建pvph-p PCI9K和pvsop26-p PCI9K真核表达载体,然后转入毕氏酵母菌GS115中并培养,经甲醇诱导后,可见大量目标蛋白r PvPH和r Pv SOP26的表达（～32k Da和～29k Da）,产量为～1000mg/L。纯化重组蛋白,并对洗脱及透析后的样品进行SDS-PAGE检测,可清晰看到目标蛋白条带。3.重组候选蛋白免疫反应性的鉴定。应用获得的重组蛋白和GST对照蛋白免疫小鼠,在初次免疫和两次增强免疫后,收集了小鼠抗血清。Western-blot的结果表明针对r PvPH和r Pv SOP26的抗血清正确识别了各自的重组蛋白。Elisa结果显示与抗GST对照的小鼠血清相比,小鼠抗r PvPH和r Pv SOP26血清中特异性抗体水平显著升高,抗体效价超过1:320000。这些结果提示了重组蛋白的免疫反应性较好。在泰国间日疟流行区收集到间日疟感染者血液,用47%Nycodenz成功纯化含有间日疟配子体的患者红细胞。IFA结果显示,在荧光显微镜下r PvPH小鼠抗血清在间日疟原虫雌性和雄性配子体表面出现较强的荧光反应,提示r PvPH保留了原虫体蛋白的天然抗原性。4.重组蛋白抗血清传播阻断效应评价。将在泰国间日疟流行区收集到的3例间日疟感染者的血液与重组候选蛋白小鼠抗血清混合,对斯氏按蚊进行了DMFA。结果显示,r Pv SOP26抗血清显著减低了2例间日疟患者血液喂养的蚊子中的卵囊密度并且在一定程度上减低了这两组蚊子中的感染率。r PvPH抗血清无论对于蚊子卵囊密度和感染率均无显著影响。5.候选蛋白基因多态性的分析。通过在泰国间日疟流行区提取的6株间日疟原虫DNA对候选蛋白的多态性进行分析,PvPH在所有虫珠中均未发现氨基酸突变,Pv SOP26发现了相同的氨基酸突变,K263N,I355S和L403I。结论:1.在间日疟原虫全基因组中预测出了两个功能未知的、符合TBVs结构和功能特点的疫苗候选蛋白,分别命名为PvPH和Pv SOP26。2.应用毕赤酵母菌表达系统成功表达了r PvPH和r Pv SOP26的重组蛋白,并确认重组蛋白保持了天然虫体蛋白的抗原性和免疫原性。3.在提取的泰国间日疟原虫DNA中,候选蛋白PvPH和Pv SOP26存在有限的基因多态性。4.在泰国的间日疟感染者样本中,r Pv SOP26小鼠抗血清表现出较强的传播阻断功能,Pv SOP26具备进一步开发为新型间日疟TBVs的潜力。