目的:探索WNT信号通路对胰腺癌细胞干性以及相关恶性生物学行为的作用,观察WNT受体Fzd7表达对体外胰腺癌干细胞亚群、耐药性及EMT的影响,阐释Fzd7以及相关WNT蛋白配体对胰腺导管腺癌恶性生物学行为的作用,希望能为胰腺癌的药物治疗提供新的研究方向,为药理学研究提供新的靶点。研究方法:（一）Fzd7表达水平分析及临床样本分析检索Oncomine数据库、R2数据库及CCLE数据库,分析Fzd7在胰腺癌中表达水平及生存预后;以生物信息学数据为线索,通过细胞实验检测Fzd7、Wnt7b在胰腺癌细胞中表达水平,采用免疫共沉淀方法（co-IP）检测二者在活细胞中共结合情况;选取胰腺导管腺癌手术样本进行组化检测分析以证实Fzd7在胰腺癌中高表达并且与Wnt7b有共表达;根据Fzd7在胰腺癌组织样本中免疫组化表达水平将病例分为高表达组与低表达组,结合临床随访资料（包括CT影像）,分析Fzd7高表达与术后肝转移发生时间以及最终临床生存时间的相关性。（二）人胰腺癌细胞干性的评价体外悬浮培养条件下富集癌症干细胞（CSC）,观察胰腺癌细胞沉默Fzd7、Wnt7b表达后形成细胞球能力的变化以及细胞球细胞中CSC特征性表型表达水平,以评价Fzd7、Wnt7b表达水平对胰腺癌细胞CSC干性能力的影响;下调普通贴壁生长胰腺癌细胞Fzd7、Wnt7b表达,以流式细胞仪检测代表CSC亚群的CD24+CD44+细胞比例的变化,Western blot检测CSC特异性表型分子ABCG2的表达水平的变化,来评价Fzd7、Wnt7b表达水平对胰腺癌细胞群体干性的影响。（三）人胰腺癌细胞耐药性的评价应用MTT法测算体外胰腺癌细胞吉西他滨IC50,用吉西他滨干预体外胰腺癌细胞后,采用流式细胞仪技术及TUNEL检测凋亡细胞及坏死细胞亚群的比例的变化,评价下调Fzd7、Wnt7b表达前后耐药性的变化;并采用Western blot检测耐药性相关蛋白ABCG2的表达。另持续浓度递增法培养建立胰腺癌吉西他滨耐药细胞,检测吉西他滨耐药细胞的CSC特征性表型蛋白表达水平来分析CSC对胰腺癌细胞耐药性的影响。（四）人胰腺癌细胞Fzd7与EMT相关性实验分析利用Wound healing实验及Transwell实验,观察Fzd7表达下调后体外胰腺癌细胞迁移侵袭能力的变化;Western blot检测胰腺癌细胞间质化表型蛋白的表达水平在Fzd7表达下调后的变化。另检测成球细胞亚群的迁移侵袭能力及EMT相关蛋白表达水平,分析CSC对胰腺癌细胞迁移侵袭能力的影响。结果:（一）Fzd7表达水平分析及人胰腺导管腺癌临床样本分析Oncomine数据库信息表明,Fzd7在胰腺癌中表达明显高于正常组织;各种Fzd受体中,Fzd7在胰腺癌中表达与正常组织相比差异性最强。而CCLE数据提示在各种胰腺癌细胞中Fzd7与19种WNT蛋白中的Wnt7b具有明显的共表达相关性,且在R2数据库信息又提示,在胰腺恶性肿瘤中,二者的相关系数达0.548;Fzd7与间质化表型分子表达、TGF-β/SMAD3信号通路分子表达均有较高的相关系数,具有统计学意义。为后续研究提供了大数据背景支持。在4种胰腺癌细胞中均检测到不同程度的Fzd7、Wnt7b表达,并且co-IP实验证实二者在活细胞中有共结合;在手术切除的胰腺癌组织中,免疫组化染色证实在胰腺导管腺癌组织中,有70%以上呈现不同程度的Fzd7表达,与正常的癌旁组织形成明显的差异性。于此同时,Fzd7与Wnt7b有明显的共表达染色印迹。（二）人胰腺癌细胞干性的评价癌细胞悬浮培养条件可以筛选出CSC,并CSC会聚集成球样繁殖生长,是目前富集癌症干细胞的普遍方法,细胞成球能力越强,细胞群体干性越强。在我们的实验中,我们首先采用转染质粒沉默胰腺癌细胞Fzd7、Wnt7b表达,在接下来的成球培养过程中癌细胞成球能力较对照组明显降低;我们又利用流式细胞仪技术以及Western blot检测细胞群体中CD24+CD44+细胞亚群占细胞总体的比例及ABCG2表达水平,这些分子被认为是干细胞特征性表型分子。结果提示:在Fzd7、Wnt7b表达下调后,CD24+CD44+细胞亚群占细胞总体的比例随之降低,ABCG2表达水平也随之降低。而我们另进行悬浮培养获得胰腺癌干细胞球,并以普通贴壁生长胰腺癌细胞做对比,结果发现,富集了CSC的细胞球中CD24+CD44+细胞亚群比例、ABCG2表达水平明显高于普通贴壁培养的细胞,Fzd7、Wnt7b表达也明显提高,因此我们推测Fzd7、Wnt7b在CSC扩增繁殖过程中发挥了重要作用。（三）人胰腺癌细胞耐药性的评价我们采用胰腺癌一线化疗药物吉西他滨进行干预,采用MTT法、流式细胞仪及TUNEL技术来检测干预效果受Fzd7、Wnt7b表达水平的影响。结果发现在Fzd7、Wnt7b表达下调后,吉西他滨IC50降低,受相同剂量吉西他滨作用后流式细胞仪及TUNEL法检测到的坏死及凋亡细胞所占比例均明显提高。用吉西他滨诱导胰腺癌细胞SW1990产生耐药性,Western blot检测发现ABCG2水平明显较普通SW1990提高,并且吉西他滨耐药的SW1990中CD24+CD44+细胞亚群比例也明显较普通SW1990高。（四）Fzd7与人胰腺癌细胞EMT的相关性我们在随访过程中发现人胰腺癌手术样本中Fzd7表达水平与术后首次发现肝转移的时间距离呈负相关。在反映癌细胞迁移侵袭能力的Wound healing实验和Transwell实验中,结果均支持Fzd7表达水平与胰腺癌细胞的迁移侵袭能力呈正相关,具有统计学意义。癌细胞悬浮培养所形成的富集了CSC的细胞球重新吹散进行贴壁培养发现,这样的细胞球细胞在Wound healing实验和Transwell实验中比普通癌细胞表现出了更强的迁移侵袭能力、表达更高水平的间质化细胞表型。由此我们推测Fzd7提高EMT程度是通过CSC比例实现的。另外在信号通路实验探索中,我们发现Fzd7也可以协同TGF-β/SMAD3信号通路诱导胰腺癌细胞发生EMT。结论:Fzd7在人胰腺导管腺癌中高表达,Fzd7高表达可以增强人胰腺癌细胞的干性、耐药性及EMT程度;Fzd7可以通过经典WNT通路的激活来提高癌症干细胞亚群来影响胰腺癌细胞耐药性和EMT程度。