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目的:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC),是我国最常见的恶性肿瘤之一,在各种恶性肿瘤的死亡率中位居第二。高迁移率族蛋白1(high-mobility group box1, HMGB1)作为一种非组蛋白核蛋白被发现在多种肿瘤中高表达,但它在肝癌中所扮演的角色目前并不清楚。在本次研究中,我们检测肝癌组织中HMGB1的表达情况,并分析HMGB1mRNA和肝癌临床病理因素之间的关系;探讨RNA干扰对人肝癌细胞株HCCLM3生物学活性的影响,并初步研究其可能的下游作用机制。方法:(1)收集11例正常肝脏组织、32例肝癌组织及其配对的癌旁组织,逆转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)和Western-blot分析HMGB1的表达水平,免疫组织化学法检测HMGB1的定位,并分析HMGB1mRNA表达水平和肝癌临床病理因素之间的关系。(2)设计并合成了3对特异性针对HMGB1的小干扰RNA序列(HMGB1-siRNA-1、HMGB1-siRNA-2和HMGB1-siRNA-3),通过脂质体LipofectamineTM2000转染HCCLM3细胞,同时设置阴性对照组和空白对照组。实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和Western-blot检测HMGB1干扰序列对HMGB1表达的影响;MTT法检测细胞的增殖并绘制生长曲线;流式细胞术检测细胞的凋亡;Transwell法检测细胞迁移和侵袭的能力。(3)Real-time PCR和Western-blot检测HMGB1干扰序列转染进入HCCLM3细胞后NF-KB/p65和VEGF-C的表达水平,间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence)检测NF-κB/p65的定位,酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测NF-KB/p65的活性。结果:(1)RT-PCR结果表明HMGB1mRNA的相对表达量在肝癌组织中最高,为0.859±0.159,明显高于癌旁组织的0.506±0.131和正常肝脏组织的0.413±0.086(P<0.001)。HMGB1mRNA的过表达与肝癌的TNM分期、Edmondson分级、血管侵犯和包膜侵犯密切相关。Western-blot结果显示HMGB1蛋白在肝癌组织中的表达也是三组中最高的。相关性分析表明,组织中的HMGB1mRNA与HMGB1蛋白表达呈明显正相关(R=0.833,P<0.01)。此外,免疫组化结果显示HMGB1在肝癌中过表达,免疫染色颗粒主要位于细胞核,正常肝脏组织中未见染色,在癌旁组织中有少量染色位于细胞浆。(2) Real-timePCR和Western-blot结果表明,3条特异性针对HMGB1的小干扰RNA序列都可以抑制HMGB1的表达,其中以HMGB1-siRNA-1抑制效率最高。MTT结果显示HMGB1-siRNA-1组细胞的生长速度明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01);流式细胞术显示HMGB1-siRNA-1组细胞凋亡显著增加(P<0.01);Transwell法结果表明在HMGB1表达抑制的HMGB1-siRNA-1组细胞中,细胞迁移和侵袭的能力较阴性对照组和空白对照组明显下降(P<0.01)。(3)Real-time PCR和Western-blot结果表明,HCCLM3细胞转染HMGB1-siRNA-1后NF-KB/p65和VEGF-C的表达较阴性对照组和空白对照组明显下降(P<0.01);间接免疫荧光法结果显示HMGB1-siRNA-1组的NF-κB/P65核转位减少;ELISA结果显示HMGB1-siRNA-1组的NF-κB/P65活性降低。结论:(1)肝癌组织中HMGB1的表达明显升高;肝癌组织中的HMGB1表达水平与肝癌的TNM分期、Edmondson分级、血管侵犯、包膜侵犯正相关,其过表达可能与肝癌的发生、发展密切相关。(2)特异性针对HMGB1的siRNA序列可以有效地抑制HCCLM3细胞的增殖,促进细胞凋亡,同时抑制HCCLM3细胞迁移和侵袭的能力,HMGB1可能作为肝癌治疗的一个潜在靶点。(3)HMGB1表达抑制后,HCCLM3细胞中NF-KB/p65和VEGF-C的表达均降低,同时可以抑制HCCLM3细胞中NF-KB/p65的核转位并降低其活性,HMGB1可能通过NF-κB信号通路调节VEGF-C的表达。