论文部分内容阅读
杨树是重要的经济树种,也是研究林木基因工程的模式植物。杨树转基因技术研究可以打破种属之间的限制,突破远缘杂交不亲和性的困难,是目前杨树进行遗传改良及新品种选育的新方法。本研究以毛白杨（Populus tomentosa Carrière）为受体材料,将水稻（Oryza sativa）中一个与光呼吸改造途径相关的多基因载体GOC-PYL1305通过农杆菌介导的叶盘法导入杨树植株内,以期提高杨树光合速率并降低光呼吸损耗,最终获得高质、高光效杨树工程植株,主要研究内容如下:1、建立了高效的毛白杨再生体系。以添加0.4mg/L苄基腺嘌呤（6-BA）、0.1mg/L萘乙酸（NAA）和0.01mg/L噻苯隆（TDZ）的MS培养基为叶片分化培养基;以添加0.4mg/L苄基腺嘌呤（6-BA）和0.1mg/L萘乙酸（NAA）的MS培养基为不定芽伸长培养基;以MS0培养基为生根培养基对毛白杨不同外植体进行组培扩繁。试验结果表明,毛白杨叶片增殖系数最高可达到7.98,不定芽分化率接近100%,所建立的毛白杨再生体系为之后的遗传转化研究提供了优良的受体材料。2、以高效的组培再生体系为基础,优化了毛白杨遗传转化体系。通过抗生素敏感实验,确定了遗传转化体系中潮霉素（Hyg）最佳临界浓度为10mg/L;头孢噻肟钠（Cef）最佳抑菌浓度为200mg/L。设计正交试验确定了菌液浓度、侵染时间、预培养时间、共培养时间以及是否加入乙酰丁香酮等条件的最佳组合,建议用MS液体悬浮菌体至OD=0.6,侵染经过2d预培养的毛白杨叶片15-20min,暗培养2d,放入添加200μmol乙酰丁香酮（AS）的共培养基培养2d为毛白杨最优遗传转化体系。3、拟利用在水稻中克隆的与光呼吸改造相关的多基因载体对杨树光呼吸途径进行改造。将水稻外源基因GLO3、OXO3和CAT2（简称GOC）导入杨树叶绿体中,使杨树光呼吸产生的乙醇酸直接在叶绿体内被催化生成草酸并最终分解成CO2,减少光呼吸过程产生的H2O2对植物造成的过氧化伤害,提高植物光合效率及生物量。4、以经过组织培养的毛白杨叶片为受体材料,利用优化后的遗传转化体系对300个叶片进行转化,共得到30棵抗性芽,经过PCR初步检测,有17株抗性芽出现了特异性扩增条带,阳性率接近56.67%,再对17株抗性苗进行反转录PCR（RT-PCR）和GUS染色检测,10棵抗性植株出现了与阳性对照相同的条带,阳性率接近60%,转化率为3.33%,进一步证明高光效GOC多基因载体已经成功整合到毛白杨基因组中,并在转录水平和蛋白有表达。5、对转GOC基因的毛白杨植株进行了表型观察及光合指标的测定。结果表明,相对于野生型,转基因毛白杨的株高、地径均有增加;生长60d左右时,转基因植株叶色加深,叶面积变大;电镜结果显示叶肉细胞较野生型排列更为致密,叶片中叶绿素含量提高,植株生物量大大增加,表明转基因植株光合效率更强,积累的生物量更高。由此说明外源基因成功导入杨树基因组,并通过GOC途径成功的分流了杨树的部分光呼吸,提高了杨树生物量。