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研究背景骨缺损为人为因素或病理因素造成的骨质短缺。传统大段骨缺损的主要治疗方式有带血管蒂的腓骨移植技术、膜诱导再生技术、骨搬运技术等,其临床运用受到治疗周期长与骨折不愈合等并发症的限制。目前骨填充材料是治疗大段骨缺损的研究热点,但血管无法长入骨填充材料内部,导致骨整合不足是限制骨填充材料发展的主要原因。越来越多的基础研究表明骨移植后骨修复的基本过程是组织工程骨血管化、骨再生及骨端融合。自体或同种异体骨的血管化是关键环节,充足的血管不仅为组织的生长提供了营养物质,而且对骨再生尤其是大段骨缺损的修复过程中细胞的活性和迁移起到了关键作用。因此,本研究筛选可特异性募集人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）的适配体,并选用丝素蛋白（silk fibroin,SF）作为适配体桥接骨填充材料的媒介,来探索特异性募集HUVECs适配体特异性识别及募集的作用以及凸点修饰SF膜在体内及体外对血管化的促进作用。研究目的本研究通过选取HUVECs、提取人骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）软骨细胞筛选特异性募集内皮细胞适配体,构建凸点修饰的SF膜并建立小鼠皮肤包埋模型,探讨特异性募集内皮细胞适配体对HUVECs特异性识别及募集作用和凸点修饰SF在体内及体外对血管化的促进作用。研究方法第一部分:特异性募集内皮细胞适配体的筛选及特异性和结合力分析1.HUVECs的培养及人骨性关节炎软骨细胞（Osteoarthritis chondrocyte,OAC）的分离、鉴定、培养购买HUVECs,体外培养并扩增;提取、培养并扩增人OAC,并进行鉴定;2.文库准备及筛选将HUVECs作为正筛细胞,人OAC作为反筛细胞。将反筛细胞与文库结合,收集上清液,将上清液与正筛细胞结合,丢弃上清液。解离与正筛细胞结合的文库,收集上清液,通过PCR及凝胶电泳分析;3.高通量测序重复第2步10轮,最后取第1轮的初始液和最后一轮的样品组和磁珠对照进行高通量测序;4.适配体特异性将适配体序列用FAM荧光标记,将适配体序列分别与正筛细胞及反筛细胞结合,流式细胞仪检测FAM荧光的细胞比例;5.适配体结合力将适配体序列用FAM荧光标记,设置一系列浓度的适配体与HUVECs结合,流式细胞仪检测FAM荧光的细胞比例;第二部分:不同表面结构SF膜的制备与表征1.SF的分离与提取蚕茧在弱碱中脱去丝胶,得到不溶SF。脱丝胶的SF使用碱水解法得到可溶SF,通过超滤、离心等方式祛除杂质;2.PDMS模具的制备采用5种不同规格的砂纸作为PDMS模具,有机硅胶倒入培养皿中,制作不同表面结构的PDMS模具;3.不同表面结构的SF膜的制备将SF溶液滴在不同表面结构的PDMS模具上,烘干后得到不同表面结构的SF膜,用无水乙醇使SF膜交联;4.不同表面结构的SF膜的表征不同SF膜分别用JSM扫描电子显微镜和薄膜光学轮廓仪观察SF膜的表面形貌。用接触角测角仪检测SF膜的表面亲水性。用JPK原子力显微镜测量SF膜的表面粘附力;5.不同表面结构的SF膜的降解通过测量不同表面结构的SF膜在PBS中浸泡1、3、5、7、9、12、15、18和21天后的重量变化。第三部分:不同表面结构SF膜对HUVECs黏附和增殖及HUVECs、HASMCs血管化影响1.HUVECs、HASMCs的培养与SF膜的制备按照本研究第一部分及第二部分的实验操作步骤进行;购买HASMCs,体外培养并扩增;2.不同表面结构SF膜对HUVECs黏附的影响使用Di I标记HUVECs的细胞膜,将HUVECs在不同表面结构SF膜上培养。用显微镜观察HUVECs的数量;样品固定、脱水后用扫描电子显微镜观察;3.不同表面结构SF膜对HUVECs增殖的影响CCK-8法检测1、3、7天HUVECs在不同表面结构SF膜的增殖情况;4.不同表面结构SF膜对HUVECs、HASMCs血管化的影响在YAP通路实验中,将HUVECs接种于P5000膜上,并在添加了1μM的verteporfin的培养基上培养24h。检测HUVECs的β-actin、VEGF、b FGF、YAP、YAP-1蛋白表达量,检测YAP、YAP-1、β-actin的荧光表达量,检测β-actin、VEGF、b FGF m RNA的表达;检测HASMCs的β-actin及α-SMA蛋白表达量;第四部分:P5000SF膜对C57鼠体内血管化的影响1.P5000 SF膜的制备按照本研究第二部分的实验操作步骤进行;2.小鼠包埋模型的构建及不同表面结构SF膜的植入在小鼠的背部做一个1.5cm的皮肤切口,将SF膜放置于皮肤切口下。以假手术组作为阴性对照。在3、7天取材并固定。3.小鼠皮肤组织学切片染色获取大鼠皮肤样本,固定,石蜡切片。分别做HE染色、CD31及α-SMA免疫组化荧光检测SF周围血管生成情况。研究结果第一部分:特异性募集内皮细胞适配体的筛选及特异性和结合力分析1.人OAC生长状态良好。阿尔新蓝、番红O及HE染色鉴定结果显示为典型软骨细胞;2.高通量测序结果:出现频率最高的11条适配体序列;3.特异性结果提示:Seq2、Seq6及Seq11特异性较其他8条好;4.结合力结果提示:随着适配体浓度的提升,Seq2、Seq6及Seq11适配体可结合细胞比例也随之上升;第二部分:不同表面结构SF膜的制备与表征1.P280、P1000、P2000、P5000、P7000型号规格的砂纸为模板制作PDMS模具成功;2.扫描电子显微镜及薄膜光学轮廓仪结果提示:从P280-P7000,SF膜表面平均凸点数量增加,凸点数量范围为37～4835个/mm~2,凸点的直径范围为3～50μm。3.静态接触角结果提示:随着凸点数量的增加,SF膜静态水滴接触角增加。4.表面黏附力结果提示:随着凸点数量的增加,可增强SF膜的表面粘附力。5.SF膜降解实验结果提示:随着凸点数的增加,SF膜降解速率增加;第三部分:不同表面结构SF膜对HUVECs黏附和增殖及HUVECs、HASMCs血管化影响1.细胞黏附实验结果提示:相较于对照组,P280SF膜上黏附细胞数量无显著差异,P1000-P7000SF膜上黏附细胞数量显著较多;2.扫描电子显微镜结果提示:P280 SF膜上黏附的细胞成梭形,细胞铺展面积较小,P5000、P7000细胞铺展面积大;3.CCK-8结果提示:在第1天,与对照组比较,P2000及P5000组SF膜在450nm处吸光度显著较高,而P280、P1000、P7000无显著差异。在第3、7天5组SF膜在450nm处吸光度显著高于对照组;4.q PCR及Western Blot结果提示:P2000组及P5000组HUVECs的b FGF蛋白表达量显著高于对照组及其他3组,P280组、P5000组及P7000组b FGF的m RNA表达量显著高于对照组。P5000组HUVECs的VEGF蛋白表达量显著高于对照组及其他4组。P280组、P5000组及P7000组VEGF的m RNA表达量显著高于对照组。5.免疫组化荧光染色及Western Blot结果提示:P5000组及P7000组HASMCs的α-SMA蛋白表达量下降。P5000组及P7000组HUVECs细胞核内YAP-1表达量相较于其他3组显著上升。此外,P5000组HUVECs的YAP表达量显著低于对照组。在verteporfin处理后,P5000组HUVECs的VEGF、b FGF、YAP蛋白表达量均下降,同时YAP-1的表达量上升;第四部分:P5000 SF膜对C57鼠体内血管化的影响小鼠背部皮肤石蜡切片HE、CD31及α-SMA免疫组化染色结果提示:在第7天,P5000 SF膜周围组织的血管密度及α-SMA的表达量高于对照组。研究结论1.Seq2和Seq11对HUVECs具有较高的特异性和结合力;2.随着凸点数量的增加,凸点修饰的SF膜亲水性下降、表面粘附力增加及降解速率加快;3.随着凸点数量的增加,可增强HUVECs的黏附与增殖、加强HUVECs的VEGF和b FGF蛋白和m RNA的表达量、降低HASMCs的α-SMA蛋白表达量;凸点修饰SF膜通过激活YAP通路,使核外YAP进入细胞核内形成YAP-1,增强VEGF和b FGF的表达;4.凸点修饰的P5000 SF膜周围CD31及α-SMA蛋白表达量增高,同时周围血管数量增加,表明凸点修饰的P5000 SF膜可在一定程度上促进体内血管生成;