研究背景据2019年全球疾病负担研究和1990-2017年中国及其各省的死亡率、发病率和危险因素的系统分析,发现肺癌、结肠癌、食管癌等肿瘤在疾病负担中占主要地位。同时,这些罹患癌症的组织富含大量“屏障黏膜”,而这是固有免疫系统完成“免疫监视”功能的重要场所。中性粒细胞是固有免疫系统的重要组成部分,具有数量多、反应迅速的特点,其不仅是急性炎症的标志,也是调控适应性免疫反应和慢性炎症进程的重要参与者。研究发现,在肿瘤发生的不同阶段,中性粒细胞会表现出极大的异质性和可塑性,但目前关于中性粒细胞与肿瘤发生发展间的关系尚不明确。因此本文研究在肿瘤的不同发展阶段中,中性粒细胞的作用特点,以及中性粒细胞功能转变的分子机制,这将为探索中性粒细胞在肿瘤发生发展过程中的作用和机制提供新的思路,并可靶向中性粒细胞及相关的关键分子,改善肿瘤免疫治疗策略。食管癌是全世界研究最少和最致命的癌症之一,超过90%的食管癌是鳞状细胞癌或腺癌,并且食管鳞癌为亚洲高发癌症之一,由于早期临床症状不明显,且缺少特异的早期诊断标志物,现阶段具有难治愈、易复发、预后差等特点。食管癌发病早期常常伴随着局部组织的慢性炎症,病理切片可见食管上皮内含有中性粒细胞的浸润。但关于食管癌发生及后期的发展是否与中性粒细胞相关及具体作用和机制目前尚不清楚。因此为了研究食管癌的发生发展是否与中性粒细胞相关,及中性粒细胞在食管癌不同发展过程中的作用特点,我们分离培养了原代人源早期浸润食管鳞状细胞癌（early esophageal squamous cell carcinoma,early ESCC）细胞,鉴定了early ESCC细胞的主要生物学特征。比较分析了早期食管癌与晚期食管癌细胞中的基因和蛋白质表达水平差异,分析其是否与中性粒细胞相关,为研究中性粒细胞在早期食管癌中的作用,以及在食管癌发展后期中的作用特点提供了一定的依据。以往研究提示中性粒细胞可能受到肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）中某些细胞因子或代谢物的影响而发生表型的转换,从而影响肿瘤细胞增殖与转移。其中氨基酸代谢的改变不仅是满足肿瘤细胞增加的能量和营养需求的方式之一,也是免疫细胞发生系统重编程的原因之一,包括中性粒细胞。但是,肿瘤组织中氨基酸代谢的改变对中性粒细胞功能的影响及具体机制尚不清楚。本文我们通过筛选分析lewis肺癌细胞（Lewis lung carcinoma,LLC）和结肠癌细胞（MC38）分泌的主要氨基酸,并探索该氨基酸对肿瘤中中性粒细胞功能的影响,为研究中性粒细胞的功能重塑以及中性粒细胞在肿瘤中的作用特点及机制提供了新思路。综上,通过对中性粒细胞在食管癌、肺癌和结肠癌中,其受调控及其调控肿瘤细胞的生物学效应的初探,为中性粒细胞在肿瘤发生发展进程中的作用和机制,提供了新的线索。方法第一部分:早期食管癌细胞的原代分离培养及中性粒细胞的作用线索分析1.用酶消化法分离培养early ESCC细胞,采用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）、细胞透射电镜（transmission electron microscopy,TEM）、核型分析、细胞群体倍增时间、细胞周期、细胞平板克隆和细胞致瘤能力等技术手段检测了early ESCC细胞的主要生物学特性。2.比较早期食管癌细胞（early ESCC）与晚期食管癌细胞（ECA109）的转录物组和蛋白质组差异,初探两组细胞间的差异基因/蛋白质是否与中性粒细胞相关。第二部分:中性粒细胞在肺癌和结肠癌细胞中的作用研究1.高速氨基酸分析仪Amino SAAYA筛选LLC和MC38细胞培养上清中氨基酸（amino acids,AAs）成分。2.使用荧光谷氨酸检测试剂盒检测LLC和MC38细胞在体内和体外分泌的谷氨酸浓度。3.不同处理组的中性粒细胞（荷瘤小鼠血液和肿瘤组织分离的中性粒细胞、利鲁唑处理/不处理荷瘤小鼠肿瘤组织分离的中性粒细胞、不同浓度谷氨酸直接刺激、不同浓度利鲁唑直接刺激）与表达荧光素酶的肿瘤细胞（LLC、MC38）梯度浓度共培养,评估中性粒细胞的细胞毒性作用。4.质谱（mass spectrometry,MS）、免疫荧光（immunofluorescence,IF）和免疫印迹（western blot,WB）实验检测中性粒细胞经谷氨酸刺激后,其蛋白质水平变化和伴随的表型功能变化情况。5.用谷氨酸释放抑制剂（利鲁唑）处理荷瘤小鼠抑制谷氨酸释放后,采用细胞流式技术对LLC肿瘤模型中的中性粒细胞进行表征分析。6.在荷瘤小鼠注射抗LY6G抗体清除中性粒细胞,检测利鲁唑的抑瘤作用是否依赖于干扰谷氨酸对中性粒细胞的调控;从荷瘤小鼠（利鲁唑处理/不处理）的血液和肿瘤组织中分离出的中性粒细胞与CD8+T细胞按不同浓度比例共培养,检测不同处理组中中性粒细胞对CD8+T细胞增殖能力的影响。结果第一部分:早期食管癌细胞的原代分离培养及中性粒细胞的作用线索分析1.共分离培养了8例early ESCC标本,成功了2例,early ESCC细胞的形态多为圆形或椭圆形,表现为异型性细胞;免疫组化结果显示early ESCC细胞P63、Ki67、CK7、CK5/6呈阳性,VIM和CR呈阴性;early ESCC细胞含食管上皮样结构（张力纤维束和桥粒）,细胞内细胞器异常增生,染色体的结构和数量异常;early ESCC细胞的增殖速度比其它大多数食管癌细胞系慢,并具有潜在的致瘤能力。2.多组学分析:early ESCC细胞中与中性粒细胞脱颗粒、黏附和趋化迁移相关的蛋白质表达上调（JAM、IL36α、ITGA3、ITGA6、SLPI、PLAU）。第二部分:中性粒细胞在肺癌和结肠癌细胞中的作用研究1.在/离体的肺癌（LLC）和结肠癌（MC38）细胞均可释放大量谷氨酸。2.谷氨酸降低中性粒细胞对肿瘤细胞的细胞毒性,同时上调中性粒细胞中STAT3磷酸化水平（p-STAT3）及ARF4和RAB10的表达。3.肿瘤组织中的中性粒细胞抑制CD8+T细胞增殖。4.谷氨酸释放抑制剂利鲁唑抑制肿瘤生长,这一作用与阻断谷氨酸对中性粒细胞的调控有关。结论1.Early ESCC细胞来源于人食管鳞状上皮并具有肿瘤细胞样特性和潜在致瘤性。2.Early ESCC细胞可能诱导中性粒细胞从外周血浸入早期食管癌组织,参与中性粒细胞脱颗粒,影响食管癌的发生发展。3.谷氨酸是肿瘤细胞释放的关键AAs之一,通过上调中性粒细胞p-STAT3、ARF4和RAB10的表达,而削弱中性粒细胞杀肿瘤作用。4.谷氨酸释放抑制剂利鲁唑通过降低肿瘤中的谷氨酸浓度来恢复中性粒细胞的杀肿瘤作用。5.靶向谷氨酸及其相关受体是恢复中性粒细胞杀肿瘤能力,改善癌症患者免疫治疗效果的可能方法。