论文部分内容阅读
研究背景和目的:空气细颗粒物(fine particulate matter,PM2.5)污染一定程度上是全球城市化、工业化向绿色发展转型过程中的副产品,在全球化推动下,将伴随人类社会科技、经济和文化发展的全程。PM2.5成分中富集各类金属元素无机盐、有机物（如多环芳烃）和黑炭等,可随呼吸活动进入肺泡,一方面能够直接刺激肺泡粘膜及毛细血管周围的细胞（如:血管内皮细胞、淋巴细胞、肺巨噬细胞和肥大细胞等）,诱发各型超敏反应或毒性反应等;另一方面,PM2.5也可穿透肺泡气-血屏障入血,经循环系统蓄积于某些特定器官或组织细胞内,造成一系列负面病理生理效应。研究已发现PM2.5呼吸道暴露已经成为各种过敏性疾病发病逐年增高的重要原因,交通尾气来源PM2.5暴露与哮喘症状呈正相关,其大气浓度每上升5μg/m~3,急性喘息发生率增加10%,气短发生率增加28%。最新研究还表明,PM2.5可直接引起特应性皮炎（atopic dermatitis,AD）、湿疹、荨麻疹等过敏性皮肤病。过敏反应（变态反应）是过敏原进入机体后免疫系统为保护自己对过敏原产生的一种“过度”反应,反应的关键环节是体内肥大细胞（mast cells,MCs）的激活。除了经典的过敏原特异性免疫球蛋白E（Ig E）过敏反应途径,MCs也能被尼古丁、乙醇等物质直接激活、脱颗粒,导致机体出现类似于过敏的反应,此为类过敏反应（allergy-like reaction）。我们先前研究证实,PM2.5能够激活MCs（LAD2）,诱导其脱颗粒释放β-氨基己糖苷酶（β-Hexosaminidase,β-Hex）和IL-4,这一过程可能与其诱导细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的升高有关。特定条件下,线粒体内电子传递链（electron transport chain,ETC）中的电子“漏出”（即“电子漏”）,提前不完全还原氧气（O2）为超氧化物（·O2-）,此过程产生了细胞内绝大多数的ROS,由位于线粒体内膜上的3种呼吸链蛋白复合物I（complex I,Cox I）、II和III参与完成。真核细胞的呼吸作用依赖于线粒体ETC中电子传递以及基质内质子（H+）泵出所共同形成的线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）,ETC中电子经过Cox I、II和III,于Cox IV处传递给O2并驱动线粒体内外膜间隙的H+回流,催化氧化磷酸化生成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）供给能量。研究也发现,PM2.5可作用于支气管上皮细胞和角质形成细胞等,增加细胞内ROS,诱导MMP迅速去极化,从而影响细胞呼吸,改变能量供应并引起细胞凋亡。皮肤作为人体最大的器官,外界环境因素特别是大气PM2.5,对皮肤过敏相关症状的作用更直接、更迅速也更明显。因此,近年来PM2.5对皮肤的影响及发生机制越来越受到关注。本实验用PM2.5处理MCs,分析细胞内氧化应激与脱颗粒水平;利用N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）干预ROS生成后,进一步探讨PM2.5诱导的MCs氧化应激和活化、脱颗粒反应之间的可能关系;最后,运用Meta分析方法就PM2.5对过敏性皮肤病（AD、湿疹和荨麻疹）发病风险比值比（odds ratio,OR）做定量分析,宏观评估PM2.5污染对过敏性皮肤病发病风险的暴露量-效应关系（exposure-response relationship）。第一部分:方法:1.利用颗粒物采样器（TH-150A）于重庆市区收集PM2.5,制备DMEM混悬液;2.培养MCs（P815）;用不同浓度PM2.5（0-200μg/ml）处理MCs后,测量细胞活力和细胞内ATP含量,流式细胞术法分析MMP变化水平,检测Cox I活性和Cox III活性;3.培养MCs（P815）;用不同浓度PM2.5（0-200μg/ml）和PM2.5+NAC（10 m M）分别处理MCs 6 h和24 h,测量细胞活力、ROS生成量、β-Hex释放率和IL-4含量。结果:1.用PM2.5刺激MCs后,随着PM2.5浓度的增高,细胞活力逐渐降低;用PM2.5刺激MCs后,随着PM2.5浓度的增高,细胞ATP含量逐渐降低;各组MMP正常的细胞比例与空白对照组比较明显降低;线粒体呼吸链Cox III活性显著降低;线粒体呼吸链Cox I活性仅在PM2.5浓度达到200μg/ml时明显降低。2.使用10 m M NAC和PM2.5刺激MCs后,细胞活力显著提高;ROS生成、β-Hex释放率和IL-4含量均显著降低。结论:1.PM2.5可浓度依赖性抑制MCs存活率,降低细胞内ATP含量和MMP水平并损害呼吸链内Cox III活性,但仅在高浓度时能显著降低Cox I活性;PM2.5加剧了细胞内氧化应激水平,损害线粒体膜功能和能量供应,我们分析PM2.5诱导细胞氧化应激的机制可能与Cox III活性的抑制有关。2.抗氧化剂NAC能够降低PM2.5诱导的MCs内ROS生成,改善氧化应激;PM2.5能够诱导肥大细胞激活,增加β-Hex和IL-4的释放,而NAC可以抑制上述趋势,调节MCs活化、脱颗粒;NAC对ROS生成的抑制趋势与对β-Hex和IL-4释放抑制作用趋势相似甚至部分平行,提示氧化应激在PM2.5诱导的过敏性炎症中具有重要作用。第二部分:方法:按照选定检索词和步骤检索至2019年11月10日的Pub Med、Web of Science、中国知网（CNKI）、中国生物医学文献数据库（Sino Med）、万方和维普数据库,收集国内、外发表的关于PM2.5与过敏性皮肤病（AD、湿疹和荨麻疹）关系的研究进行Meta分析。纳入研究类型为观察性研究（包括队列研究、时间序列、病例交叉和横截面研究）,研究结果可以暴露剂量-反应关系效应量表示,即效应量可转化为PM2.5浓度每增高10μg/m~3,其对过敏性皮肤病的发生风险OR及其95%可信区间（confidence interval,CI）。分别评价PM2.5对过敏性皮肤病的发病风险OR并进行亚组分析、敏感性分析,采用Egger和Begg法检验发表偏倚并用剪补法（trim and fill method）校正OR。结果:1.总计纳入PM2.5与过敏性皮肤病关系的研究15篇。2.大气PM2.5浓度每增高10μg/m~3,对过敏性皮肤病的发生风险OR=1.0066,95%CI=[1.0033,1.0100];亚组分析表明:PM2.5对AD的发生风险OR=1.0320,95%CI=[1.0056,1.0590];对湿疹的发生风险OR=1.0066,95%CI=[1.0029,1.0103];对荨麻疹的发生风险OR=0.9994,95%CI=[0.9852,1.0139]。3.敏感性分析:逐一剔除组内的文献后,新的合并OR预估值均未发现明显变化,预估值均落在CI内,说明该分析结果稳定可靠;发表偏倚检验及校正:校正OR=1.0070,95%CI=[1.0030,1.010]。结论:PM2.5是过敏性皮肤病发生的作用危险因素,其室外大气浓度每增加10μg/m~3,过敏性皮肤病发生风险增加0.70%。