研究背景:为了保证眼用制剂的无菌性并防止其在使用中被微生物污染,大部分眼用制剂添加了抑菌剂。苯扎氯铵是具有杀菌作用的季铵盐类阳离子表面活性剂,是眼科制剂中常添加的抑菌剂。冰片,味辛、苦,性微寒,归心、脾、肺经,具有开窍醒神,清热止痛作用[1],作为中药滴眼液中常添加的一味清凉剂,在中医眼科制剂中普遍使用,目前市售的中医眼用制剂均含有冰片[2]。现代药理研究表明,苯扎氯铵可直接导致角膜、结膜上皮细胞死亡或凋亡[3];冰片单用及与其他药物合用,可增加肿瘤细胞的凋亡[4-7];并且冰片能够增强苯扎氯铵对兔角膜上皮细胞的毒性作用[8]。氮酮(Azone)是一种优良的皮肤促渗透剂,因为能加强抑菌剂苯扎氯铵的眼损伤而被排除在眼科用药之外[9.10],目前尚无研究表明,同样具有促渗透作用[11-16]的冰片在眼科制剂使用中具有合理性。苯扎氯铵是常用的抑菌剂,目前市售的中医眼用制剂均含有冰片[2]。一些经常使用滴眼液的患者(如青光眼和干眼症),以及已有眼表创伤的患者(外伤、白内障及LASIK术后),往往同时滴用多种制剂;含有冰片的中药滴眼液都是常用的OTC药物,往往被认为纯中药成分而忽略其中添加的抑菌剂。故临床上,同时接触冰片及抑菌剂苯扎氯铵的情况很常见。为确保二者安全合理使用,进一步的有关两者合用的毒理机制研究,具有迫切的临床意义和重要的理论价值,这对于预防药源性干眼症,深入评价中药眼科制剂的安全性也有着深远的意义。细胞凋亡,是基因控制的细胞的一种自主有序性死亡。目前已知导致细胞凋亡的两个主要途径分别是线粒体途径和死亡受体途径,另外机体还存在其他凋亡途径,如P53通路等等[17]。线粒体凋亡途径,主要通过Bcl-2家族蛋白介导[18];死亡受体途径,主要通过死亡配体与受体的结合,形成死亡信号复合体,最终都可通过激活caspase级联反应,诱导细胞凋亡。常见的死亡受体有Fas,可与其配体FasL结合,引起caspase级联反应,最终激活caspase-3,导致细胞的凋亡。据报道Fas受体的表达可由P53诱导增加,从而激活死亡受体途径[19,20];P53还可直接激活Bcl-2家族,启动线粒体凋亡途径,引起细胞凋亡[21]。因此我们从细胞凋亡的机制、通路入手,探讨天然冰片与苯扎氯铵合用后,对角膜上皮细胞的细胞活性、凋亡率、及凋亡相关基因和蛋白的表达的作用,为二者的合理用药及中药眼用制剂的安全性,提供前期研究,具有迫切的临床意义和重要的理论价值。目的:探讨天然冰片与苯扎氯铵合用后,对角膜上皮细胞的细胞活性、凋亡率、及凋亡相关基因和蛋白的表达的作用,为二者的合理用药及中药眼用制剂的安全性,提供前期研究。方法:以兔角膜上皮细胞为研究对象,用MTT法检测冰片与苯扎氯铵合用对兔角膜上皮细胞活性的影响;用Annexin-V/PI染色流式细胞仪检测法,检测冰片与苯扎氯铵合用对兔角膜上皮细胞凋亡的影响;用Real time RT-PCR法,检测冰片与苯扎氯铵合用对兔角膜上皮细胞Fas、P53、Bcl-2、Caspase3、Caspase9等mRNA表达的影响;用Western Blot法,检测冰片与苯扎氯铵合用对兔角膜上皮细胞凋亡相关蛋白Fas、Caspase3、Caspase9等蛋白表达的影响。结果:1、苯扎氯铵(2,4,8 μg/mL)与冰片(100,200,400μg/mL)合用后,可明显增强苯扎氯铵对角膜上皮细胞活性的抑制作用(P<0.01);且不同浓度的冰片,可呈剂量依赖性的促进苯扎氯铵的细胞毒性,差异有统计学意义(P<0.01)。2、苯扎氯铵与冰片合用后,可明显增强苯扎氯铵对角膜上皮细胞的促凋亡作用(均P<0.01);且冰片可呈剂量依赖性的促进苯扎氯铵的细胞凋亡作用,差异有统计学意义(均P<0.01)。3、冰片与苯扎氯铵合用后,与同浓度的苯扎氯铵单用组比较,冰片可呈剂量依赖性促进角膜上皮细胞Fas、P53、caspase-9、caspase-3等凋亡基因的mRNA表达(P<0.01)。4、除冰片100μg/mL+苯扎氯铵4μg/mL合用组外,冰片与苯扎氯铵合用后,均可呈剂量依赖性的增强苯扎氯铵对角膜上皮细胞Fas蛋白、Caspase3蛋白表达的促进作用(P<0.05,P<0.01);另外冰片也呈现剂量依赖性的促进苯扎氯铵对Caspase9蛋白的表达,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:天然冰片与苯扎氯铵合用,可剂量依赖性的促进苯扎氯铵的细胞毒性,促进兔角膜上皮细胞的凋亡及凋亡相关基因、蛋白的表达。冰片和苯扎氯铵合用引起的促角膜上皮细胞凋亡作用,可能是通过P53、Fas等介导的死亡受体和线粒体两种凋亡途径共同作用的结果。