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目的卵巢组织冻存是青春期前及放化疗无法延迟的女性目前保存生育力的主要选择,卵巢组织自体移植后借助辅助生殖技术全球活产新生儿已超过130例。玻璃化冷冻技术因操作简单近年来逐步发展,目前存在大量涉及冷冻保护剂(抗冻蛋白、藻酸盐、抗氧化剂等)的有效性及安全性应用研究,以期提高冷冻保存效率及移植成功率。槲皮素具有高活性氧清除和离子螯合活性,并能增强抗氧化酶的活性,临床上可用于骨质疏松症、卵巢肿瘤、肺和心血管疾病等的预防治疗,其作为冷冻保护剂可改善软骨组织及精子冷冻保存效果,理论上也可用于卵巢组织玻璃化冷冻以期提高冻存效率。本研究在卵巢组织冷冻保护剂中添加不同浓度梯度的槲皮素,探讨其抗氧化作用对卵巢组织冷冻复苏后卵泡活性的影响。方法1.选取8-10个月龄健康性成熟未孕母羊18只,共获得36只卵巢,处理并获取长8mm、宽4mm、厚1mm的卵巢皮质组织块。2.将组织块随机分配到新鲜对照组(18块)、玻璃化冷冻组(26块)、添加1μmol/L槲皮素玻璃化冷冻组(26块)、添加5μmol/L槲皮素玻璃化冷冻组(26块)、添加10μmol/L槲皮素玻璃化冷冻组(26块)。除新鲜对照组外,各组卵巢组织块以相应的冷冻保护剂进行玻璃化冷冻,液氮保存2周后复苏。3.组织复苏后,每组各10块固定并制作切片,1/2进行苏木素-伊红(HE)染色形态学分析,1/2进行原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测及增殖细胞核抗原(PCNA)、锰超氧化物歧化酶(SOD-2)免疫组化分析;另外每组8块体外培养并测定培养后第1、3、5、7、9天培养液中雌二醇水平,8块检测组织匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)水平。结果1.新鲜对照组原始卵泡正常形态率621/738(84.1%)、初级卵泡正常形态率207/272(76.1%),均高于其余各冷冻组,差异有统计学意义(P<0.001);添加1μmol/L槲皮素冷冻组的原始卵泡正常形态率为566/740(76.5%),高于玻璃化冷冻组556/775(71.7%)(P=0.035);但添加10μmol/L槲皮素组的原始(431/704 61.2%)、初级(159/290 54.8%)卵泡正常形态比例最低(P<0.05)。2.新鲜对照组基质细胞密度(细胞数/100μm2)为(142.88±24.91),与玻璃化冷冻组(138.38±34.37)、添加 1μmol/L 槲皮素组(138.03±28.53)、添加5μmol/L 槲皮素组(140.00±27.55)、添加 10μmol/L 槲皮素组(130.05±27.80)相比差异无统计学意义(P>0.05)。3.玻璃化冷冻组CAT(U/mgprot)含量为(3.48±1.21),添加槲皮素各组组织CAT含量均相对升高,差异有统计学意义(P=0.006);与玻璃化冷冻组GSH-PX(U/mgprot)含量为(244.87±55.04)相比,添加1μmol/L 槲皮素组GSH-PX含量(325.07±95.26)升高,差异无统计学意义(P>0.05)。4.对于SOD-2平均光密度值,新鲜对照组0.26(0.25,0.28)低于各冷冻组,添加1μmol/L槲皮素组0.54(0.53,0.55)最高,与玻璃化冷冻组0.32(0.29,0.51)相比差异有统计学意义(P<0.05)。5.新鲜对照组凋亡细胞计数(细胞数/400X视野)为(13.92±3.88),明显少于玻璃化冷冻各组,差异有统计学意义(P<0.001);各冷冻组相比,添加1μmol/L槲皮素组凋亡细胞计数(50.96±24.28)最少,添加10μmol/L槲皮素组凋亡细胞计数(127.12±42.46)最多,差异有统计学意义(P<0.05)。6.添加10μmol/L槲皮素组的雌激素测定曲线偏低,但玻璃化冷冻组、添加1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L槲皮素组的雌激素测定曲线与新鲜对照组相比无明显统计学差异(P>0.05)。结论1.在卵巢组织冷冻保存中,添加低浓度槲皮素可以提高卵巢组织内相关抗氧化酶的水平,使卵巢组织复苏后卵泡活性、基质细胞密度较好保存。2.10μmol/L槲皮素在卵泡正常形态、卵泡活性的保存中未发挥有利作用。3.槲皮素具有剂量相关性,过高浓度的槲皮素可能具有细胞毒性,进而诱导细胞凋亡。