背景和目的:目前应用组织工程骨(tissue-engineered bone,TEB)修复骨缺损已取得良好的效果,但是当骨缺损处存在感染或潜在感染时,单纯的TEB移植结合全身的抗感染治疗可能难以控制和治愈局部感染。这主要是因为TEB移植到宿主局部后很难在短时间内同宿主间建立良好的血供关系,血液中的药物很难在缺血局部形成有效的杀菌浓度,潜在的细菌大量繁殖引起移植物的感染,导致移植失败。自从链霉素骨水泥链珠出现后,大量的在骨组织局部应用抗生素缓释进行抗感染治疗的研究不断涌现,并且取得了令人鼓舞的成绩。目前,主要应用可降解的生物相容性好的材料进行抗生素缓释,这样可以避免如同骨水泥类不可降解材料需要二次手术取出,减少患者痛苦。为此,本实验主要目的包括:(1)制备出具有可降解特性的万古霉素藻酸盐缓释微球,并优化其缓释性能; (2)将微球与间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)共培养,观察其对MSCs的增殖与成骨分化的影响; (3)利用已建立的微动型交锁髓内钉系统固定山羊股骨段状骨缺损模型,将优化的万古霉素微球复合构建的组织工程骨移植到骨缺损处,观察移植物局部药物的缓释和成骨情况。方法:(1)采用滴注法制备万古霉素藻酸盐缓释微球,再用纤维蛋白凝胶包裹微球,通过高效液相色谱仪测定其释放天数。(2)以万古霉素对标准金黄色葡萄球菌的生物活性为标准,评价缓释的万古霉素的抗菌活性,并应用临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作为对象,评价缓释的万古霉素同万古霉素药物标准品之间的差异。(3)通过细胞表面的特异抗原标志和多方向分化潜能来鉴定通过密度梯度离心法分离的山羊MSCs。(4)用生长曲线、流式细胞计数、免疫组织化学、real-time RT-PCR及western blot等技术观察微球缓释液对山羊MSCs的增殖及成骨诱导分化的影响。(5)用同种异体山羊DBM与自体MSCs构建TEB,通过基因转染技术对MSCs进行荧光标记,用激光共聚焦成像及扫描电镜技术观察MSCs在DBM上生长、增殖及体内的成活情况。(6)以研制的交锁髓内钉作为固定系统创建新型山羊股骨段状骨与骨膜缺损模型,将优化的万古霉素微球复合构建的TEB移植到骨缺损处,通过抽取局部的组织液观察移植物局部万古霉素缓释情况,通过抽取移植前后静脉血测定肌酐和尿素氮的变化。(7)按照山羊模型的股骨缺损处移植物的不同,分三组:实验组,优化的1g万古霉素微球复合构建的TEB;组织工程对照组,单纯的TEB而无微球;空白微球对照组,TEB复合1g纤维蛋白凝胶包裹的藻酸盐微球,但无万古霉素。利用X线评分,双能X线分析、大体观察、组织病理学和生物力学测试等方法观察移植物成骨情况,通过放射性核素骨显像和墨汁灌注观察移植物部位的血供情况。结果:(1)应用滴注法成功制备了万古霉素藻酸盐缓释微球,不同的万古霉素和藻酸盐溶液混合后制备的微球中万古霉素含量不同,其中50mg/mL万古霉素和16%藻酸盐溶液的混合液制备的微球的载药量最高,为(27.36±0.90)%,75mg/mL和90mg/mL纤维蛋白溶液包裹的微球释放的时间最长,高效液相色谱仪测得的释放天数为23。(2)万古霉素对标准金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)的最小的抑菌浓度和杀菌浓度分别为1.20mg/L和2.10mg/L,药物敏感的折点值为5mg/L,75mg/mL纤维蛋白溶液包裹的微球缓释的万古霉素到达药物敏感的折点值的最长释放时间为19d,对于耐药菌株的作用显示,缓释的万古霉素具有同万古霉素药物标准品相同的杀灭作用。(3)采用常规的密度梯度离心法分离山羊骨髓中的单个核细胞,贴壁生长,呈成纤维细胞样,其第三代细胞表面分子CD29、CD44阳性率分别为98.70%和99.54%,而CD62L、CD45阳性率仅为1.10%和0.73%,RT-PCR、免疫组化和病理特殊染色证实细胞具有向成骨、成软骨和成脂肪分化的能力。(4)用不同浓度的万古霉素微球缓释液培养鉴定的MSCs,浓度低于或等于15.00g/L的微球缓释液培养的MSCs的细胞周期和生长曲线同对照组无显著差异,混合培养的MSCs更倾向于形成钙结节,碱性磷酸酶(ALP)活性也相应地增加,表达更高水平的成骨相关基因的mRNA(ALP、Ⅰ型胶原和骨桥蛋白)和蛋白质(RUNX2、Ⅰ型胶原和骨钙素)。(5)通过带有绿色荧光蛋白的逆转录病毒感染MSCs,用其同DBM构建TEB,通过激光共聚焦成像技术和扫描电镜技术观察到细胞移植到体内后仍可大量存活,并分布于新生骨小梁中。(6)术后抽取局部组织液定量分析显示,放置药物缓释微球的局部(右侧)其有效的杀菌维持天数为21,血液中达到杀菌浓度的维持天数为2,而放置不含万古霉素的微球的对照侧(左侧)未达到杀菌浓度,术后与术前相比,血中肌酐和尿素氮的浓度并无显著增加。(7) TEB联合微球移植模型,16周后X线观察骨折端为新生骨组织充填,股骨力线正常,无明显的侧弯,扭转、成角现象,4枚锁钉均位于锁孔内,无折断和退钉,实验组同组织工程对照组及空白微球对照组相比,Samantha X线评分差异并无统计学意义,实验组骨密度值(BMD)为(1.30±0.16)g/cm2,同对照组相比亦无显著差异。(8)术后16周,测定实验组术侧股骨和健侧股骨的极限扭曲力的比值,实验组为(79.1±6.5)%,组织工程对照组(80.2±5.1)%,空白微球对照组(77.1±1.8)%,各组间差异无统计学意义。(9)放射性核素骨显像显示术后4、8周实验组的T/NT比值同对照组相比未见显著差异(p>0.05),16周的墨汁灌注及组织病理学染色均显示,各个实验组的TEB血管呈网状分布,排列规律,管径大小相对一致,再生骨组织切片断面均可见较为成熟的骨单位,无淋巴细胞,再生的骨结构接近于正常皮质骨,典型的同心圆排列的哈佛氏系统有序排列。结论:(1)制备的万古霉素藻酸盐微球具有良好的载药量和缓释性能,纤维蛋白凝胶的包裹可以显著延长体外释放时间。(2)微球缓释的万古霉素具有同万古霉素药物标准品相同的生物活性。(3)分离纯化得到山羊的MSCs,低于或等于15.00g/L的万古霉素藻酸盐微球缓释液对其增殖无明显影响,但具有一定的促成骨分化作用。(4)逆转录病毒携带的EGFP示踪MSCs可行,证实细胞移植体内仍可存活并参与新骨形成。(5)万古霉素微球复合组织工程骨移植股骨缺损模型,在局部可以形成有效的药物浓度,达到杀菌浓度的缓释时间可以满足治疗需要,TEB再生骨组织的成骨质量并未受缓释微球的影响,提示该系统适合于骨缺损伴骨感染的治疗应用。