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本实验室前期研究者发现rhCNB具有抗肿瘤作用。本研究认为rhCNB很可能是通过与免疫细胞上的受体相互作用而使免疫细胞发挥抗肿瘤功能的。实验应用受体放射性配基结合分析法将125I标记的rhCNB与小鼠腹腔巨噬细胞结合,检验其最大结合量和解离常数发现rhCNB与巨噬细胞是有特异结合的。为了获知rhCNB受体存在于细胞的哪个部位以决定纯化的实验策略,采用异硫氰酸荧光素标记的rhCNB与巨噬细胞孵育,经激光共聚焦显微镜观察发现rhCNB的受体分布于巨噬细胞的膜上。 实验采用膜蛋白的分离纯化方法对rhCNB在小鼠腹腔巨噬细胞上的受体进行纯化,得到的蛋白经质谱分析鉴定结果为整合素α M,是整合素αMβ2的亚基。为了验证纯化及质谱分析结果是否正确,应用流式细胞术和免疫杂交分析对质谱分析获得的结果进行了再鉴定,实验结果表明所获得的质谱鉴定结果是正确的。 为了分析rhCNB与小鼠腹腔巨噬细胞作用后的功能变化,实验首先对前炎症细胞因子TNFα、IL-1β、IL-6等的表达进行了分析研究。实验设计中,与rhCNB具有相同受体的纤维蛋白原做为阳性对照,亲合素不是整合素αMβ2的配体,做为阴性对照。实验发现rhCNB可诱导这些前炎症细胞因子的表达。但是,rhCNB诱导巨噬细胞表达这些前炎症细胞因子的能力大大弱于亲合素和纤维蛋白原的强诱导能力。 为了找到rhCNB诱导巨噬细胞所产生的特异性较强的具有抗肿瘤作用的细胞因子,对肿瘤坏死因子家族的现有成员进行了检测,发现rhCNB诱导巨噬细胞表达肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)的能力显著强于纤维蛋白原的此种能力,而且亲合素没有这种能力。 rhCNB和纤维蛋白原都是αMβ2的配体,都可以使巨噬细胞表达TRAIL上调。实验结果表明,rhCNB和纤维蛋白原诱导前炎症细胞因子和TRAIL的表达之间似乎存在着相反的关系。 本研究首先得到rhCNB的受体为αMβ2,又通过对肿瘤坏死因子家族18个成员的筛选发现rhCNB诱导TRAIL表达显著上调,为了验证TRAIL的表达上调是受体αMβ2的生物学效应,本实验用封闭剂整合素αM的单克隆抗体和普通肝素证明了。rhCNB经过αMβ2的介导通过信号转导途径最终导致了TRAIL表达上调。 本研究以rhCNB具有抗肿瘤作用这个最终效应为依据,经过寻找受体、分离纯化受体、鉴定受体、确定rhCNB功能、确认受体与生物学效应的关系等一系列过程,探索了rhCNB抗肿瘤的主要机理,即rhCNB经过受体整合素αMβ2的介导而使巨噬细胞TRAIL表达上调,TRAIL可以诱导肿瘤细胞凋亡。