抗河豚毒素的基因工程单链抗体的制备

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河豚毒素(TTX)是一种小分子量的、胍盐神经毒素,它主要通过抑制神经或肌肉组织的钠离子(Na+)电压门控通道起作用,从而导致神经麻痹、呼吸困难甚至是死亡。但是到目前为止,针对河豚毒素的有效的、快速灵敏的检测方法还没有出现,而发展针对河豚毒素的免疫学方面的检测方法是非常有必要的。在本试验中,我们首先通过一种化学方法(曼尼希反应)来制备了河豚毒素的完全人工抗原(TTX-BSA:作为检测用抗原;TTX-KLH:作为免疫用抗原),并且采用了小量的、重复的免疫方式,实验组总共免疫了3只Balb/c小鼠。从免疫好的小鼠的脾脏中提取其全RNA,并反转录合成cDNA的第一条链,以此作为模板通过常规的PCR反应扩增了抗体的重、轻链的可变区基因(VH和VL),配以适当分子数的Linker((G4S)3),通过重叠延伸PCR组装成了一个可以无限制编码抗河豚毒素(TTX)的重组的单链抗体(scFv)基因。通过噬菌体展示技术,构建了一个依托于噬菌体质粒载体pCANTAB-5E的噬菌体展示文库。在经过辅助噬菌体M13KO7的再感染后,单链抗体就会展示在噬菌体的表面,然后再经过六轮的淘选过程,我们获得了可以和河豚毒素(TTX)特异性结合的抗体,并通过间接ELISA对其进行了定量的分析,选定其中的一株亲和力最高的单克隆(scFv-T53)进行了单链抗体的可溶性表达和各方面性质的分析研究,通过间接ELISA测定选定的单克隆的亲和力常数为1.1×106L/mol。我们还通过生物信息学的手段,分析了scFv-T53的基因序列、氨基酸序列,预测了scFv-T53的可变区的划分、二级结构、物理化学性质等。各种分析结果表面。本实验成功的从构建的噬菌体抗体库中筛选得到了特异的抗河豚毒素(TTX)的单链抗体。
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