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背景ANKIB1含有丰富的结构域和模体,如RBR结构域和TRAF6结合模体,其中RBR结构域与泛素连接酶活性关系密切。泛素连接酶在蛋白质泛素化过程中起着至关重要的作用,与细胞凋亡、细胞周期循环、癌症发生等过程密切相关。TRAF6是一种核心接头蛋白,作为白介素-1受体、TNF受体和Toll样受体超家族的主要信号传导子,介导NF-κB、Smad等多种信号通路。ANKIB1含有三个TRAF6结合位点,可能对TRAF6介导的NF-κB通路具有调节作用。本课题将研究ANKIB1的泛素连接酶活性及其与TRAF6的关系,探讨ANKIB1对TRAF6相关信号通路的影响。目的1、确定ANKIB1的泛素E3连接酶活性和相关机制。2、分析ANKIB1对TRAF6泛素化及其介导NF-κB信号通路的影响。方法1、ANKIB1泛素连接酶活性研究在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达GST-UbcH5b、GST-UbcH7、GST-UbcH8、 GST-ANKIB1(1-480)、His-Ub、His-ANKIB1(330-570)等融合蛋白。利用镍琼脂糖凝胶FF柱亲和层析纯化His-tag蛋白；利用Glutathione Sepharose4B柱亲和层析纯化GST-tag蛋白。GST pull-down筛选与ANKIB1相互作用的泛素E2结合酶,通过体外泛素化实验检测GST-ANKIB1(1-480)、His-ANKIB1(330-570)的泛素E3连接酶活性。2、ANKIB1对TRAF6泛素化的影响通过免疫共沉淀检测ANKIB1与TRAF6的相互作用,并确定ANKIB1与TRAF6互作的具体位点。通过免疫沉淀法研究ANKIB1对TRAF6自泛素化的影响：转染或共转染ANKIB1、TRAF6、Ub重组质粒,使用TRAF6抗体沉淀蛋白,使用Ub抗体通过Western Blotting检测免疫沉淀中的泛素化蛋白。3、ANKIB1对TRAF6介导NF-κB信号通路的影响采用双报告基因法研究ANKIB1对NF-κB通路的影响：转染或共转染ANKIB1、 TRAF6、ANKIB1(1-480)、ANKIB1(481-780)、ANKIB1(781-1089)和pNF-κB-Luc、 pRL-SV40双报告基因质粒,检测过表达ANKIB1条件下,相对荧光素酶活性的变化。将ANKIB1、TRAF6、ANKIB1(1-480)、ANKIB1(481-780)、ANKIB1(781-1089)重组质粒按一定组合方式转染细胞,经IL-1刺激,Western Blotting检测细胞中IKK、IκB表达水平的变化。结果1、纯化出了His-Ub、GST-UbcH5b、GST-UbcH7、GST-UbcH8、GST-ANKIB1(1-480)、 His-ANKIB1(330-570)融合蛋白。2、GST pull-down法证明ANKIB1能够与3种泛素结合酶UbcH5b、UbcH7、UbcH8结合,初步确认ANKIB1具有泛素连接酶活性。3、ANKIB1及其3个截短体ANKIB1(1-480)、ANKIB1(481-780)、ANKIB1(781-1089)能与TRAF6相互作用。4、ANKIB1通过降低TRAF6的泛素化水平,减弱了IKK磷酸化水平、增强了IκB的稳定性,进而抑制TRAF6介导的NF-κB信号通路活性。结论1、ANKIB1是一种RBR型泛素连接酶。2、ANKIB1通过与TRAF6相互作用,降低了TRAF6的泛素化水平,进而降低NF-κB活性,为ANKIB1功能的深入研究奠定了基础。