论文部分内容阅读
研究背景:动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）,是一种脂质代谢类疾病,也是一种慢性无菌炎症性疾病,严重危害人类健康。血液中的单核细胞迁移至动脉内膜,分化成为巨噬细胞后,通过膜表面的清道夫受体,识别和摄取氧化低密度脂蛋白（Oxygenized low density lipoprotein,oxLDL）,负荷脂质,最终成为“巨噬源性泡沫细胞（Macrophage-derived foam cells,MDFC）”,参与AS发生发展的各个阶段。MDFC形成之后,表现为炎症表型,分泌炎性细胞因子,作用于其他免疫细胞,加速炎症反应。MDFC的迁移能力也发生下降,驻留在内膜中,造成斑块的不稳定。同时还可以分泌活性氧（Reactive oxygen species,ROS）,促进炎性细胞因子的生成,内皮细胞的损伤以及LDL的氧化。鉴于MDFC在AS的发生发展中发挥着重要的作用,探讨与其形成有关的因素或分子至关重要,将为AS的预防和治疗提供新的靶点。CD36是巨噬细胞识别和摄取oxLDL最主要的清道夫受体。oxLDL和CD36结合后,引发CD36下游信号通路的活化,导致oxLDL的进一步摄取、炎性细胞因子的分泌增加、以及细胞迁移能力的下降,进一步促进MDFC的形成。聚合的肌动蛋白（F-actin）在MDFC的形成中也发挥重要的作用。在MDFC中,肌动蛋白聚合的增加不仅抑制细胞的迁移,而且可以促进CD36和oxLDL复合物的内化。蛋白4.1R最初发现为一种红细胞膜骨架蛋白,后被证明其在真核细胞中也广泛表达。蛋白4.1R作为细胞骨架和膜蛋白之间衔接子,在多种细胞中发挥作用。研究发现,蛋白4.1R不仅影响细胞骨架的功能,参与F-actin相关的细胞活动,还可以通过影响细胞膜表面的受体表达来影响其下游信号通路的活化,参与细胞功能的调节。研究目的:本课题利用oxLDL诱导野生型(4.1R+/+)和4.1R基因缺陷型(4.1R-/-)巨噬细胞,构建MDFC模型。通过研究蛋白4.1R对MDFC中脂质的积累、炎症表型以及迁移能力的影响,探究蛋白4.1R在MDFC形成中发挥的作用。同时,通过研究蛋白4.1R对MDFC中CD36的表达和下游关键信号分子Lyn的活化以及肌动蛋白聚合的影响,探讨蛋白4.1R参与MDFC形成的机制。研究方法:1.通过油红O染色及胆固醇含量试剂盒检测细胞中脂滴和胆固醇的含量。2.荧光定量PCR法检测MDFC中蛋白4.1R在mRNA水平的表达。3.T7核酸内切酶I和Western Blot验证4.1R-/-巨噬细胞中蛋白4.1R的表达情况。4.油红O染色及胆固醇含量试剂盒检测4.1R+/+MDFC和4.1R-/-MDFC中脂滴和胆固醇的含量。5.荧光定量PCR法和ELISA分别检测4.1R+/+MDFC和4.1R-/-MDFC中炎性细胞因子IL-1β、IL-6以及MCP-1的表达与分泌。6.流式细胞术检测4.1R+/+MDFC和4.1R-/-MDFC中ROS的表达。7.利用Transwell以及划痕实验检测蛋白4.1R缺失对MDFC迁移能力的影响。8.荧光定量PCR法检测4.1R+/+MDFC和4.1R-/-MDFC中CD36,SR-A在mRNA水平上的表达。9.荧光显微镜以及流式细胞术检测4.1R+/+巨噬细胞和4.1R-/-巨噬细胞摄取oxLDL的情况。10.流式细胞术检测4.1R+/+MDFC和4.1R-/-MDFC膜表面CD36的表达。11.Western Blot检测4.1R+/+MDFC和4.1R-/-MDFC中CD36下游信号通路中关键信号分子Lyn的活化。12.流式细胞术及免疫荧光检测4.1R+/+MDFC和4.1R-/-MDFC中肌动蛋白的聚合。研究结果:1.利用oxLDL成功构建MDFC。2.MDFC中蛋白4.1R在mRNA水平的表达升高。3.T7核酸内切酶I和Western Blot分别从基因水平和蛋白水平鉴定了4.1R-/-巨噬细胞。4.与4.1R+/+MDFC相比,4.1R-/-MDFC中脂滴和胆固醇的含量较低。5.与4.1R+/+MDFC相比,4.1R-/-MDFC中炎性细胞因子IL-6、IL-1β、MCP-1以及ROS的表达量较低。6.4.1R-/-MDFC的迁移能力大于4.1R+/+MDFC的迁移能力。7.4.1R-/-MDFC与4.1R+/+MDFC相比较,CD36的转录水平较低,SR-A的转录水平无显著差异。8.与4.1R+/+巨噬细胞相比较,4.1R-/-巨噬细胞对oxLDL的摄取能力较弱。9.流式细胞术检测发现,4.1R-/-MDFC膜表面的CD36表达低于4.1R+/+MDFC。10.oxLDL刺激后,4.1R-/-MDFC中Lyn的活化低于4.1R+/+MDFC。11.4.1R-/-MDFC与4.1R+/+MDFC相比,肌动蛋白的聚合能力较弱。研究结论:蛋白4.1R在MDFC形成过程中起正向调控的作用,蛋白4.1R缺失的MDFC中,脂滴的含量相对较少,炎症表型减轻,细胞的迁移能力提高。对其机制进行研究发现,蛋白4.1R可能通过影响CD36的表达和下游信号Lyn的活化,以及肌动蛋白的聚合,从而影响MDFC的形成。