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目的观察氟非尼酮(Fluorofenidone, AKF-PD)抑制转化生长因子-p1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)诱导原代正常肺成纤维细胞(Normal Human Lung fibroblasts, NHLFs)活化和细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)合成的作用,探讨调控小窝蛋白-1(caveolin-1,cav-1)表达在AKF-PD抗肺纤维化机制中的作用。方法1. NHLFs的原代培养、鉴定及纯化传代：于肺叶切除术中取病变远端的正常肺组织,采用组织块培养法进行NHLFs的原代培养,将培养的细胞纯化传代至第3代细胞冻存备用。2.取NHLFs第3-7代使用,首先将实验分为5组(n=5),分别为空白对照组(N组)、TGF-β1(10ng/ml)处理组(M组)、TGF-β1(10ng/ml)+高、中、低浓度AKF-PD(200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml)治疗组(A200、A400、A800组),各组于细胞接种后相应处理12h、24h、48h、64h、72h,收集细胞提取总蛋白,采用Western Blot检测cav-1、α-平滑肌动蛋白(Alpha smooth muscle actin,α-SMA)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的蛋白表达；3.取NHLFs第3-7代使用,由上海吉玛制药技术有限公司设计、制备得到3个不同序列的正常人cavl-siRNA,再将实验分为7组,分别为空白对照组(N组)、TGF-β1(10ng/ml)处理组(M组)、Co-siRNA转染组、Co-siRNA+TGF-β1(10ng/ml)处理组、cavl-siRNA转染组、cav1-siRNA+TGF-β1(10ng/ml)处理组、cavl-siRNA+TGF-β1(10ng/ml)+AKF-PD(400μg/ml)处理组,各组于细胞接种后相应处理48h,收集细胞提取总蛋白,采用Western Blot检测cav-1、α-SMA、FN的蛋白表达。结果1.随着TGF-β1(10ng/ml)作用时间的延长,cav-1的表达逐渐减少(p<0.05),并且具有时间依赖性;细胞α-SMA、FN的表达先增加后减少(p<0.05)。TGF-β1能显著下调细胞cav-1的表达(p<0.05),能明显上调细胞α-SMA、FN的表达(p<0.05),细胞活化与ECM合成的最佳时间为48h时。3.随着AKF-PD(200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml)浓度的增加,与TGF-β1(10ng/ml)共同接种细胞48h后,细胞cav-1的表达逐渐增加(p<0.05),细胞α-SMA、FN的表达逐渐减少(p<0.05),并且具有剂量依赖性。AKF-PD作用的最佳浓度为400μg/ml,能显著抑制TGF-β1的作用,能部分恢复细胞cav-1的表达(p<0.05)能明显下调细胞α-SMA、FN的表达(p<0.05)。4.Co-siRNA转染对cav-1表达无影响：Co-siRNA转染后,与N组比较,细胞cav-1、α-SMA及FN的表达差异无统计学意义(P>0.05)。5.cavl-siRNA成功干扰cav1的表达：cavl-siRNA转染后,与N组比较,细胞cav-1的表达几乎消失(p<0.05),细胞α-SMA、FN的表达差异无统计学意义(P>0.05)。而最佳转染序列为cavl-siRNA-2,细胞cav-1沉默最明显(p<0.05),细胞α-SMA、FN的表达几乎与N组相同。6.TGF-β1处理后的Co-siRNA转染组：与单纯Co-siRNA转染组比较,细胞cav-1的表达明显减少(p<0.05),细胞α-SMA、FN的表达明显增多(p<0.05);与M组比较,细胞cav-1、α-SMA、FN的表达差异无统计学意义(P>0.05)。7.TGF-β1处理后的cav1-siRNA转染组：与单纯cav1-siRNA转染组比较,细胞cav-1的表达有所减少,但差异无统计学意义(P>0.05),细胞α-SMA、FN的表达明显增多(p<0.05)；与M组比较,细胞cav-1的表达明显减少(p<0.05),细胞α-SMA、FN的表达有所减少(p<0.05)。8.TGF-β1+AKF-PD共同处理后的cav1-siRNA转染组：与TGF-β1处理后的cav1-siRNA转染组比较,细胞cav-1、α-SMA、FN的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论1. AKF-PD能有效地抑制TGF-β1诱导的NHLFs活化和ECM合成。2. AKF-PD能有效地上调TGF-β1刺激的NHLFs上cav-1的表达。3.调控cav-1的表达是AKF-PD抑制TGF-β1诱导的NHLFs活化和ECM合成的关键机制。