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研究背景结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tuberculosis）感染引起的一种慢性传染病。在宿主抵御M tuberculosis感染中,T细胞介导的免疫应答发挥主要作用。卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin,BCG）是唯一获得临床许可的结核病疫苗。新生儿接种BCG可预防对儿童罹患严重的结核病,但对成人缺乏有效的保护。其中的原因可能是BCG主要诱导的是效应记忆T细胞（Effector memory T cells,TEM）介导的免疫应答,并非是中央记忆型T细胞（Central memory T cells,TCM）,而不能提供长期的抗结核免疫保护。BCG初免-亚单位疫苗加强免疫的策略被认为是提高成人免疫力的一种可行途径。然而,在亚单位疫苗加强BCG的动物实验和临床试验中,亚单位疫苗强化免疫并未诱导获得长期免疫保护。因此,迫切需要研究如何在BCG免疫基础上利用亚单位疫苗诱导长期存活记忆T细胞,从而增强长期的抗结核免疫保护。抗原的成分、刺激次数和免疫间隔都会影响记忆T细胞的生成。我们实验室前期研究发现适当延长结核亚单位疫苗接种间隔为0-4-12周有助于促进长期存活记忆T细胞的免疫应答。本课题在此基础上研究BCG初免后,结核亚单位疫苗的免疫次数和接种间隔对长期存活记忆T细胞的影响。此外,细胞因子白细胞介素7（Interleukin 7,IL-7）和白细胞介素 15（Interleukin 15,IL-15）被用于疫苗佐剂增强T细胞免疫记忆。本实验室前期研究中发现,重组腺病毒rAd-IL-7-Linker-IL-15和重组腺相关病毒rAAV-IL-7辅助结核亚单位疫苗能够促进长期存活记忆T细胞的形成。因此,在本课题中我们进一步在BCG初免基础上,研究rAAV-IL-7和rAAV-IL-7-Linker-IL-15对T细胞免疫记忆的佐剂效应。进一步探索了 IL-7对T细胞活化的调节作用。研究目的1.在BCG初免基础上,研究BCG抗原与BCG缺失抗原亚单位疫苗的强化免疫方案（接种次数及间隔时间）对T细胞免疫记忆的影响。2.在BCG初免基础上,研究rAAV-IL-7和rAAV-IL-7-Linker-IL-15辅助亚单位疫苗的强化免疫对T细胞免疫记忆的作用。3.探索IL-7在T细胞活化中对泛素系统的调节作用。研究方法1.BCG初免基础上,由BCG抗原和BCG缺失抗原构成的不同亚单位疫苗的强化免疫接种方案对T细胞免疫记忆的影响。（1）疫苗制备。构建及纯化重组结核分枝杆菌融合蛋白ESAT6-CFP10（EC）。融合蛋白Mtb10.4-HspX（MH）由本实验室前期构建。佐剂为双十八烷基二甲基溴化铵（Dimethyl dioctadecyl ammoniumbromide,DDA）和聚肌胞苷酸（Polyriboinosinic polyribocytidylic acid,Poly I:C）的混合物（DP）。MH 和 EC分别与DP混合制备成MH/DP和EC/DP疫苗,分别代表BCG抗原和BCG缺失抗原构成的亚单位疫苗。（2）免疫方案。6-8周龄C57BL/6小鼠皮下接种BCG（5 × 105 CFU/只）。长免疫间隔方案:BCG免疫后,MH/DP和EC/DP疫苗分别在第12-24周和第12-16-24周进行加强免疫;在第24周加强免疫BCG一次作为强化免疫对照;同时设立PBS和BCG仅免疫一次组为对照。短免疫间隔方案:BCG免疫后,MH/DP在第8-14周和EC/DP在第8-10-14周加强免疫。PBS和BCG仅免疫一次组为对照。（3）免疫检测。末次免疫后12周和28周进行免疫检测,主要检测记忆T细胞介导的免疫应答,具体如下:①流式细胞术检测脾脏CD4+和CD8+T细胞分泌IL-2、IFN-γ的比例与细胞数。②延长ELISPOT方法检测脾细胞中TCM的数量。③抗原两次重复刺激后,流式细胞术检测脾细胞产生IFN-γ的CD4+和CD8+T细胞数目,反映长期存活记忆性T细胞的功能。④Pentamer法检测脾脏TB10.4特异性CD8+T细胞的比例。⑤EdU法检测脾脏CD4+T细胞的增殖能力。⑥ELISA检测血清中抗原特异性抗体IgG、IgGl和IgG2c的水平。⑦H37Ra菌株攻击实验评价疫苗诱导的记忆性T细胞免疫保护作用。2.BCG初免基础上,rAAV-IL-7和rAAV-IL-7-Linker-IL-15辅助结核亚单位疫苗MH/DP强化免疫对T细胞免疫记忆的影响。（1）重组腺相关病毒构建。利用腺相关病毒辅助系统构建和包装腺相关病毒rAAV-EGFP、rAAV-IL-7 和 rAAV-IL-7-Linker-IL-15。（2）免疫方案。6-8周龄C57BL/6小鼠皮下接种BCG（5 × 105 CFU/只）。BCG免疫后12周,亚单位疫苗MH/DP分别联合rAAV-EGFP、rAAV-IL-7和rAAV-IL-7-Linker-IL-15,强化免疫2次,间隔12周,病毒剂量均为5 × 106 PFU/只,其中rAAV-EGFP作为对照组。（3）免疫检测。疫苗强化免疫后1周观察疫苗诱导的短期免疫应答。末次免疫后的第12到26周观察疫苗诱导的长期免疫应答。①流式细胞术检测脾淋巴细胞表面标志物CD44和CD62L,反映CD4+和CD8+T细胞中TEM和TCM的比例。②抗原特异性记忆T细胞的免疫检测方法同上。（4）IL-7影响T细胞免疫记忆的分子机制研究。①特异性识别OVA257-264肽段的OT-I转基因小鼠模型研究:rAAV-IL-7联合OVA257-264抗原刺激7天后,磁珠分选方法分选出CD8+T细胞,Western blot分析脾脏CD8+T细胞中IL-7受体下游信号分子Akt、Foxol、IL-7R和c-Myc的变化,RT-PCR分析脾脏CD8+T细胞中转录因子的变化;②EL4小鼠淋巴瘤细胞模型研究:IL-7与抗原PMA刺激细胞后,Western blot 分析 Akt、Foxol 和 IL-7R 分子的变化;③IL-7 敲除（IL-7 Knock out,IL-7KO）鼠模型研究:RT-PCR分析IL-7 KO与野生型（Wild type,WT）小鼠脾脏CD4+T和CD8+T细胞中信号分子及转录因子的差异。3.IL-7在T细胞活化中对泛素系统的调节作用。（1）OT-I小鼠模型。将OVA257-264抗原和rAAV-IL-7共同免疫OT-I小鼠,7天后,磁珠分选脾脏CD8+T细胞。RT-PCR和Western blot检测泛素酶及去泛素酶转录水平及蛋白水平的变化。（2）EL4小鼠淋巴瘤细胞模型。IL-7及PMA刺激细胞1小时或3小时后,Western blot方法检测泛素酶及去泛素酶的变化。（3）IL-7 KO模型。分选IL-7 KO小鼠与WT小鼠脾脏CD4+T细胞和CD8+T细胞,RT-PCR方法比较泛素酶及去泛素酶转录水平的变化。（4）泛素编辑酶A20对T细胞免疫记忆的影响。制备重组腺相关病毒rAAV-A20;rAAV-A20联合亚单位疫苗免疫C57BL/6小鼠,免疫后3天和7天,RT-PCR和Western blot检测CD4+T和CD8+T细胞中调控T细胞分化的转录因子的变化。研究结果1.BCG初免基础上,BCG抗原与BCG缺失抗原亚单位疫苗需要采用不同免疫接种方案以诱导T细胞长期免疫记忆。BCG免疫后,MH/DP在第12-24周加强免疫2次和EC/DP在第12-16-24周加强免疫3次,促进形成T细胞长期免疫记忆,具体表现为:①产生IFN-γ的CD4+和CD8+T细胞的比例:末次免疫后12周,与MH/DP在 12-16-24 周加强组（0.82±0.46）和 EC/DP 在 12-24 周免疫组（0.61±0.21）相比,MH/DP在12-24周加强组的CD4+T细胞分泌IFN-γ的比例显著增加（1.97 ±0.70,P＜0.05）。与 PBS 组（0.23±0.12）和 BCG 加强组（0.36±0.15）相比,MH/DP 在 12-24 周加强组（0.88±0.32）和 EC/DP 在 12-16-24 周免疫组（1.33±0.56）的CD8+T细胞产生更多的IFN-γ（P＜0.05）。②分泌IFN-γ的T细胞数目:末次免疫后28周,延长ELISPOT实验结果显示与EC/DP在12-24周免疫组（86.2±33.7 SFCs/5×106个细胞）相比,MH/DP在12-24周加强组诱导了更多数量的分泌IFN-γ的抗原特异性长期存活记忆T细胞（166±22.4 SFCs/5 × 106 个细胞）（P＜0.05）。与 MH/DP 在 12-16-24 周加强组（73±52 SFCs/5 × 106细胞）相比,EC/DP 在 12-16-24 周免疫组（162.25±18.3 SFCs/5 × 106个细胞）显著增加了分泌IFN-γ的抗原特异性长期存活记忆T细胞的数目（P＜0.05）。③CD4+T细胞分泌IFN-γ的比例:末次免疫后28周,抗原重复刺激后发现与EC/DP 在 12-24 周免疫组（1.59±0.34）和 MH/DP 在 12-16-24 周加强组（1.00±0.38）比较,MH/DP在12-24周加强组（3.58±0.37）的CD4+T细胞分泌IFN-γ的比例增高（P＜0.05）。与 MH/DP 在 12-16-24 周加强组（1.00±0.38）相比,EC/DP 在12-16-24周免疫组的CD4+T细胞分泌IFN-γ的比例增加（3.27±1.21,P＜0.05）。④TB10.4特异性CD8+T细胞的比例:末次免疫后19周,与BCG组比较,BCG免疫后,MH/DP在第12-24周加强组诱导更多的TB10.4特异性CD8+T细胞数（P＜0.05）。⑤EdU+CD4+T细胞的比例:末次免疫后12周,与MH/DP在12-16-24周加强 3 次组（1.42±0.63）比较,MH/DP 在 12-24 周加强 2 次组（2.18±0.32）和 EC/DP在12-16-24周免疫3次组（2.00±0.36）的EdU+细胞比例显著增加。末次免疫后28 周,与 MH/DP 在 12-16-24 周加强 3 次组（1.20±0.78）和 EC/DP 在 12-24 周组免疫2次组（1.89±0.82）相比,MH/DP在12-24周加强2次组（2.83±0.57）中EdU+细胞比例更多（P＜0.05）。⑥肺部菌载量:末次免疫后19周,无毒力的结核分枝杆菌H37Ra通过滴鼻方式感染小鼠。结果显示MH/DP在12-24周加强组和EC/DP在12-16-24周免疫组降低了肺组织中的细菌负荷,与BCG组相比降低了约0.1 log10 CFU（P＜0.05）。BCG免疫后,缩短亚单位疫苗免疫接种间隔,MH/DP在第8-14周加强免疫和EC/DP在第8-10-14周加强免疫,疫苗诱导的T细胞增殖能力及抗结核的保护能力低于BCG免疫组。与T细胞免疫记忆不同,对抗体水平的检测表明MH/DP或EC/DP在第12-16-24周强化三次血清中的抗原特异性IgG、IgG1、IgG2c的水平高于强化免疫2次组,增高的抗体滴度在末次免疫后28周仍保持较高水平。2.BCG初免基础上,rAAV-IL-7辅助结核亚单位疫苗MH/DP强化免疫增强T细胞免疫记忆。BCG免疫后,rAAV-IL-7促进CD4+TCM和TEM细胞的生成,rAAV-IL-7-Linker-IL-15促进CD8+TEM细胞的生成。表现在末次免疫后12周,与BCG+MH/rAAV-EGFP 组相比,BCG+MH/rAAV-IL-7 组中 CD4+TCM 细胞和 CD4+TEM细胞的比例增加（P＜0.05）。与 BCG+MH/rAAV-EGFP 组（38.8±2.9）相比,BCG+MH/rAAV-IL-7-Linker-IL-15 的 CD8+TEM细胞的比例增高（43.34±5.1,P=0.03）。BCG免疫后,rAAV-IL-7而不是rAAV-IL-7-Linker-IL-15增强结核亚单位疫苗MH/DP诱导的T细胞短期免疫应答。结果表明,在第一次和第二次加强免疫后的第 7 天,与 BCG+MH/rAAV-EGFP 对照相比,BCG+MH/rAAV-IL-7 提高了疫苗诱导的产生IFN-γ的CD4+T细胞的比例（0.8±0.1,0.3±0.07）和CD8+T细胞的比例（1.1±0.2,0.35±0.06）（P＜0.05）。BCG免疫后,rAAV-IL-7而不是rAAV-IL-7-Linker-IL-15增强结核亚单位疫苗MH/DP诱导的T细胞长期免疫应答。主要表现为:①产生IFN-γ或IL-2的CD4+T细胞比例:末次免疫后12周,与BCG+MH/rAAV-EGFP组（0.24±0.05）和 BCG+MH/rAAV-IL-7-Linker-IL-15 组（0.33 ±0.03）相比,BCG+MH/rAAV-IL-7 组促进 CD4+T 细胞分泌IFN-γ（0.63±0.08,P＜0.05）。与 BCG 组（1.23±0.27）比较,BCG+MH/rAAV-IL-7 组促进 CD4+T细胞分泌 IL-2（1.72±0.14,P＜0.05）。②CD4+和CD8+T细胞分泌IFN-γ的比例:末次免疫后12周,抗原重复刺激后发现与 BCG 组、BCG+MH/rAAV-EGFP 组和 BCG+MH/rAAV-IL-7-Linker-IL-15组相比,BCG+MH/rAAV-IL-7组促进了 CD4+T细胞和CD8+T细胞分泌IFN-γ的比例和数量（P＜0.05）。末次免疫后25周,与BCG+MH/rAAV-EGFP组（CD4+T 和 CD8+T 细胞分别为 0.5±0.09,1.07±0.3）相比,BCG+MH/rAAV-IL-7 组增加了 CD4+T 细胞（0.7±0.05,P=0.04）和 CD8+T 细胞（1.73±0.27,P=0.04）分泌IFN-γ的比例。③TB 10.4特异性CD8+T细胞的比例:与BCG+MH/rAAV-EGFP组比较,BCG+MH/rAAV-IL-7组可以增加TB10.4特异性CD8+T细胞数（P＜0.05）。④EdU+CD4+T细胞的比例:末次免疫后12周,与BCG+MH/rAAV-EGFP组（1.96±0.13）和 BCG+MH/rAAV-IL-7-Linker-IL-15 组（1.67±0.16）相比,BCG+MH/rAAV-IL-7 组（2.57±0.33）的 EdU+细胞比例显著增加（P＜0.05）。⑤肺部菌载量:末次免疫后26周,无毒力的结核分枝杆菌H37Ra通过滴鼻方式感染小鼠。结果显示rAAV-IL-7辅助MH/DP减少肺组织中的细菌负荷,比BCG组降低约 0.2 log10 CFU（P＜0.05）,比 BCG+MH/rAAV-EGFP 组降低约 0.1 log10 CFU（P＜0.05）。此外,rAAV-IL-7可以活化OT-I小鼠脾脏CD8+T细胞中Akt-Foxol的信号,增加CD8+T细胞中控制记忆分化相关的转录因子Eomes、Tcf7、Id3、Bach2的转录水平表达。IL-7促进EL4小鼠淋巴瘤细胞中Akt-Foxol-IL-7R的表达。IL-7 KO小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞中IL-7受体下游信号及控制记忆T细胞分化的转录因子表达降低。3.IL-7在T细胞活化中对泛素系统的调节作用。①rAAV-IL-7与OVA257-264抗原免疫OT-I小鼠。7天后,与载体组比较,rAAV-IL-7促进了 CD8+T细胞中胞内蛋白的泛素化修饰;也促进了泛素酶Cbl-b、Fbxo38的转录和降低了去泛素化酶Usp15和Usp18的转录;同时增加了泛素酶肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）及泛素编辑酶A20的转录及蛋白的表达。②PMA与IL-7分别单独刺激或共刺激EL4小鼠淋巴瘤T细胞1小时或3小时后,发现泛素酶TRAF6及泛素编辑酶A20蛋白水平的表达增加,并且在蛋白酶体抑制剂存在3小时的情况下,A20的表达更高。③IL-7 KO小鼠脾脏CD4+T和CD8+T细胞中A20的转录水平下降。④rAAV-A20联合亚单位疫苗调控T细胞分化的转录水平,表现在上调记忆分化的转录因子Foxol和IL-7r及下调控制效应分化的转录因子Blimp1的表达。研究结论1.BCG免疫后,BCG抗原MH/DP在12-24周加强免疫2次和BCG缺失抗原EC/DP在12-16-24周加强免疫3次可以促进结核亚单位疫苗诱导T细胞长期免疫记忆。2.BCG免疫后,重组腺相关病毒rAAV-IL-7辅助结核亚单位MH/DP在12-24周加强免疫可促进疫苗诱导的T细胞短期免疫应答和TCM介导的长期免疫记忆。3.IL-7在T细胞活化中调节泛素系统,可促进泛素酶TRAF6及泛素编辑酶A20的表达。