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目的骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome,MDS）是起源于造血干/祖细胞的异质性髓系克隆性疾病,常伴有病态/无效造血,并呈高风险向急性髓系白血病（secondary acute myeloid leukemia,s AML）转化的趋势。迄今为止,MDS发病和进展的具体机制尚未明确,部分MDS患者可伴有DNMT3A、TET2等基因突变或5q-、-7等染色体异常,但是并非所有患者均出现上述异常改变,因此很难用基因突变或染色体异常解释全部MDS患者发病和进展原因。临床工作中去甲基化药物地西他滨能逆转MDS抑癌基因启动子DNA甲基化,延迟向AML转化,提示表观遗传修饰在其中扮演重要角色。本研究旨在探究MDS转白过程中差异甲基化基因SLIT2的临床意义,鉴定SLIT2启动子区CpG岛高甲基化调控的靶分子,并分析其具体的抗白血病作用及分子机制。方法通过全基因组简化甲基化测序分析5例配对MDS转白标本,筛选出与MDS疾病进展相关的差异性甲基化基因。应用实时定量甲基化特异性PCR和亚硫酸氢盐测序PCR扩大标本验证MDS转白前后SLIT2甲基化改变,并分析其临床意义。应用实时定量PCR检测SLIT2甲基化可能调控靶分子的表达水平,并分析与SLIT2甲基化的相关性。以去甲基化药物处理MDS/AML细胞株,进一步鉴定SLIT2甲基化调控的靶分子。构建靶分子稳定过表达细胞株,观察细胞增殖、周期、凋亡、分化、集落形成等生物学行为改变。建立小鼠白血病模型,通过活体成像、处死后组织HE染色和免疫组化、骨髓活检及细胞免疫分型等观察对白血病及肿瘤生长的影响。RNA-FISH用于明确靶分子lnc RNA的细胞内定位。通过转录组测序和预测网站筛选甲基化依赖的靶lnc RNA/miRNA分子的下游基因,经双荧光素酶实验和AGO2-RIP实验证明基因间直接靶向结合。通过敲减或恢复下游靶基因m RNA表达,进一步阐明其参与MDS转变的机制。结果1.MDS进展相关差异甲基化基因SLIT2的筛选及其甲基化改变的临床意义。经测序分析5例配对的MDS转白标本,筛选出与MDS疾病进展相关的差异性甲基化基因SLIT2。扩大标本检测发现11例配对MDS/s AML患者s AML期SLIT2启动子区CpG岛甲基化水平和密度显著升高,且AML患者SLIT2甲基化水平显著高于对照和MDS患者,提示SLIT2甲基化可能参与MDS疾病进展。临床参数分析发现在MDS中SLIT2高甲基化组患者不良核型及中危-2/高危组比例显著高于SLIT2低甲基化组,在AML中完全缓解（complete remission,CR）期SLIT2甲基化较初发时显著降低。生存分析提示SLIT2甲基化趋近于是影响MDS/非APL/CN-AML患者不良预后的独立因素。在再生障碍性贫血、溶血性贫血和巨幼细胞性贫血等非MDS血细胞减少性疾病中,骨髓SLIT2甲基化水平较MDS患者均明显降低。2.SLIT2启动子区CpG岛高甲基化调控的靶分子鉴定。临床标本中SLIT2表达较健康对照显著上调,并且本课题组和TCGA数据均显示SLIT2甲基化与其表达并无相关性。用SLIT2重组蛋白处理白血病细胞,结果发现重组SLIT2蛋白能够促进白血病细胞HEL和SKM-1增殖、抑制细胞凋亡,发挥促白血病作用。上述结果提示:SLIT2启动子区CpG岛高甲基化并不是通过调控SLIT2表达发挥作用。检索UCSC网站发现SLIT2基因内含有2个非编码RNA:长链非编码RNA SLIT2-IT1和miR-218-1。临床标本中SLIT2-IT1在初发AML中下调,获得CR后表达稍恢复,并且SLIT2-IT1低表达组患者的总体生存时间显著缩短。Spearman相关分析提示SLIT2-IT1表达与SLIT2甲基化呈负相关。针对miR-218-1,其成熟体miR-218-1-3p表达与SLIT2甲基化并无相关性,而另一成熟体miR-218-5p（简写为miR-218）在AML中表达下调且与SLIT2甲基化呈负相关。去甲基化药物处理细胞后SLIT2启动子区发生去甲基化改变而SLIT2-IT1/miR-218表达上调。上述结果提示:SLIT2启动子区CpG岛高甲基化可能通过调控SLIT2-IT1/miR-218表达而发挥作用。3.Lnc RNA SLIT2-IT1的抗白血病作用及其分子机制。构建SLIT2-IT1的过表达稳转株观察细胞功能发现SLIT2-IT1过表达并不影响红白血病细胞株K562和HEL的增殖和凋亡,提示SLIT2-IT1可能并不参与红白血病的发生发展。而在HL60以及MDS转白细胞株SKM-1中SLIT2-IT1过表达后细胞增殖和集落形成能力减弱,而凋亡比例增高。周期实验发现SLIT2-IT1可使SKM-1和HL60出现G0/G1期阻滞。体内实验发现SLIT2-IT1过表达可以延缓NCG鼠形成AML的进程。小鼠生存实验也发现SKM-1/SLIT2-IT1组小鼠生存期显著延长。脏器组织的HE染色和免疫组化提示两组小鼠肝、脾、卵巢和皮下则出现了不同程度的转移。骨髓活检、染色体核型和细胞免疫分型发现小鼠骨髓出现原始细胞浸润,且对照组小鼠发生髓系白血病。为探索SLIT2-IT1抗白血病作用的分子机理,首先通过FISH检测确认SLIT2-IT1位于细胞浆内,据此以ce RNA模式探索下游机制。应用Illumina Hiseq测序和lnc RNA/miRNA靶基因预测网站分别预测筛选出SLIT2-IT1潜在下游靶miRNA和m RNA—miR-3156-3p和BMF,经AGO2-RIP和双荧光素酶实验证实miR-3156-3p可与SLIT2-IT1和BMF靶向结合。敲减靶基因BMF m RNA表达后,细胞增殖速度加快、集落形成能力增加,凋亡比例降低,细胞G0/G1期比例也下降,G2/M期比例增加,逆转了SLIT2-IT1过表达对细胞增殖的抑制、对凋亡的促进以及对G0/G1期阻滞作用。4.Mi R-218的抗白血病作用及其分子机制。构建miR-218的过表达稳转株观察细胞功能发现miR-218过表达可抑制细胞增殖和集落形成,促进细胞凋亡。周期实验发现miR-218可使HEL、SKM-1和HL60出现G0/G1期阻滞。此外,miR-218过表达可使HL60细胞CD235a表达增加,提示miR-218可促进HL60细胞向红系分化。体内实验发现miR-218过表达也可以延缓NCG鼠形成AML的进程。脏器组织的HE染色和免疫组化提示对照组小鼠卵巢出现了阳性转移灶。骨髓活检、染色体核型和细胞免疫分型发现小鼠骨髓出现原始细胞浸润,两组小鼠均发生髓系白血病。为探索miR-218抗白血病作用的分子机理,通过Illumina Hiseq测序和网站预测筛选出miR-218下游靶基因HOXA1,并经双荧光素酶证实HOXA1可与miR-218靶向结合。“挽救”实验发现,恢复HOXA1表达可使细胞增殖和集落形成能力提高,凋亡比例降低,细胞G0/G1期比例也下降,G2/M期比例增加,逆转了miR-218过表达对细胞增殖的抑制、对凋亡的促进以及对细胞周期的阻滞现象。结论1.MDS和AML患者SLIT2启动子区CpG岛呈现高甲基化改变,并且异常高甲基化可能参与MDS疾病进展。2.SLIT2启动子区CpG岛异常甲基化与MDS及AML患者预后不良相关,并可用于AML治疗缓解的监测。3.SLIT2启动子区CpG岛高甲基化可能通过调控内含基因SLIT2-IT1/miR-218而非自身基因SLIT2表达而发挥作用。4.Lnc RNA SLIT2-IT1可通过竞争性吸附miR-3156-3p进而调控下游BMF表达,发挥抗白血病作用。5.Mi R-218可通过靶向结合下游HOXA1 3’UTR,调控HOXA1表达,发挥抗白血病作用。