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牙髓炎（pulpitis）是口腔临床中的常见病多发病,发病率与患病率极高。牙髓由于其解剖位置的特殊性,一旦发生炎症所造成的损伤多为不可逆的。牙髓炎的病因主要是由于细菌感染,内毒素（endotoxin）是革兰氏阴性细菌的胞壁脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）,可在细菌死亡崩解时释放出来,是细菌的主要致病因子。一般在临床上就诊的牙髓炎患者也多为不可逆性牙髓炎,目前临床对于不可逆性牙髓炎的治疗多采用根管治疗术（root canal therapy,RCT）。根管治疗术虽然能够有效地解决牙髓炎的疼痛症状,抑制炎症的进一步发展,但是却不可避免的在操作中彻底破坏了牙髓组织的活性。患牙牙髓组织对其牙体硬组织的供养被彻底切断,大大减少了牙齿的使用寿命。因此,明确牙髓炎发病的分子机理与影响因素,寻找一种不破坏牙髓组织活性来治疗牙髓炎的方法具有重要的理论意义。干扰素调节因子7（Interferon regulatory factor 7,IRF7）是调节Ⅰ型干扰素（Interferon,IFN）（尤其是IFN-α）产生的最重要的转录因子。最初被认为仅在抗病毒反应和Ⅰ型IFN产生中发挥作用。后来被证明是细胞周期和凋亡、微生物感染以及炎症的关键调节器。IFN-α具有重要的免疫调节功能,特别是在炎症方面,可以趋化单核、巨噬细胞等免疫细胞;上调多种细胞表面MHC-Ⅰ类分子表达,有助于刺激T细胞增殖、分化。基于此,我们猜测IRF7是主要调控IFN-α表达的转录因子,调节IRF7-IFN-α信号通路相关基因的表达可能对LPS诱发的牙髓炎起到一定的治疗作用。目前,有关LPS感染后,干扰或减弱IRF7活性来治疗牙髓炎的研究未见报道。免疫调节性脱氧寡核苷酸（regulatory oligodeoxynucleotides,rODN）指具有免疫调节（抑制）活性的脱氧寡核苷酸,亦称免疫抑制性脱氧寡核苷酸（suppressive oligodeoxynucleotides,s ODN）。rODNs多为人工合成的具有特定核苷酸顺序的单链DNA分子,其序列与自身细胞DNA相似。rODNs可抑制由核酸类病原体相关模式分子（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）和或损伤相关模式分子（damage-associated molecular patterns,DAMPs）激发的固有免疫应答而减少自身组织细胞的损伤。研究表明,rODN对细菌引起的脓毒血症有治疗作用。综上,本论文通过研究一种抑制性脱氧寡核苷酸（MS19）对人牙髓细胞中IRF7-IFN-α信号通路相关基因表达水平的影响,探讨MS19在炎症应答中的作用及可能机制,为牙髓炎的临床治疗提供新靶点和有价值的实验依据。具体如下:目的:本研究通过建立牙髓炎体外模型,观察LPS感染激活的局部免疫应答中IRF7的表达和活化以及IRF7-IFN-α信号通路相关蛋白因子m RNA水平的改变,应用靶向IRF7的抑制性脱氧寡核苷酸,干扰IRF7-IFN-α信号通路,进一步调控相关分子,降低炎症反应,为临床牙髓炎的治疗提供了新思路。方法:收集2020年1月至2020年12月期间就诊于吉林大学口腔医院口腔颌面外科门诊,18-23周岁年轻患者拔除的完整、无龋、牙周健康的第三磨牙,采用组织块与酶结合的方法提取人牙髓干细胞（human Dental Pulp Stem Cells,hDPSCs）。流式细胞术鉴定hDPSCs表面干细胞标志物表达。通过细胞计数试剂（cell counting kit 8,CCK8）方法及多向分化方法检测hDPSCs增殖分化能力。通过不同浓度LPS刺激hDPSCs不同时间,采用实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）检测相关炎症因子表达,进而确定出LPS诱导人牙髓细胞炎症模型的最佳作用浓度和最佳作用时间。为了检测LPS是否激活hDPSCs中IRF7-IFN-α信号通路,我们通过q RT-PCR法检测牙髓炎模型细胞中IRF7-IFN-α信号通路中关键基因的表达。进一步利用MS19对该信号通路进行干扰,采用q RT-PCR、western blot和ELISA等实验方法检测了IRF7-IFN-α信号通路关键基因的表达,探讨MS19对该信号通路的免疫调节作用以及对LPS诱导牙髓炎的治疗作用,阐明MS19通过调控IRF7-IFN-α信号通路治疗牙髓炎症的可能分子机制。所有数据用Graphpad prism 8.0统计软件进行分析,各组细胞RGR符合正态分布,以x±s表示,多组间样本均数比较采用单因素方差分析,组间样本均数两两比较采用Tukey检验。以P＜0.05为差异有统计学意义,P＜0.01、P＜0.001代表差异极其显著,所有的实验数据至少进行3次重复测试。结果:1.hDPSCs体外分离培养与鉴定:通过组织块与酶结合方法提取的hDPSCs,体外培养的原代间充质干细胞成长梭形,流式细胞术鉴定结果显示:hDPSCs表面间充质干细胞表面标记物CD90、CD105呈阳性表达,而造血干细胞表面标志物CD34、CD45呈阴性表达,符合hDPSCs表面抗体表达,故提取的细胞为hDPSCs。CCK8法测定hDPSCs的细胞增殖曲线显示:hDPSCs增殖活力较好。体外诱导的hDPSCs在特定的诱导条件下,其可以向成骨、成脂方向分化,具有良好的多向分化潜能。2.牙髓炎细胞模型的建立:通过q RT-PCR法检测hDPSCs在0.05μg/m L、0.1μg/m L、0.2μg/m L、0.5μg/m L、1μg/m L和1.5μg/m L浓度的LPS刺激下,1μg/m L组炎症因子表达水平最高（P＜0.01）,然后我们选取1μg/m L浓度的LPS刺激hDPSCs 0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h下,6h组hDPSCs的炎症因子表达水平最高（P＜0.01）。故1μg/m L LPS刺激hDPSCs 6h为LPS最佳作用浓度与最佳作用时间。即建立人牙髓炎细胞模型的条件:1μg/m L的LPS刺激hDPSCs 6h。3.LPS对hDPSCs中IRF7-IFN-α信号通路的激活作用:为了检测LPS感染引起的局部免疫应答中IRF7-IFN-α信号通路相关蛋白因子m RNA水平的改变,我们通过体外培养hDPSCs建立的牙髓炎体外模型,观察了LPS感染后细胞中IRF7和IRF7-IFN-α信号通路相关蛋白分子m RNA的表达水平。结果显示:LPS感染后可显著提高hDPSCs中TLR4、IRF3、IRF7、IFN-α、IFN-β和CXCL10的m RNA水平（P＜0.05）。4.MS19对牙髓炎模型细胞中IRF7-IFNα信号通路的免疫调节作用:为了研究IRF7和IRF7-IFN-α信号通路在LPS感染诱发牙髓炎中的作用,我们选取一种抑制性脱氧寡核苷酸（MS19）,观察其对IRF7-IFN-α信号通路相关基因表达水平的影响,结果显示:MS19能够抑制牙髓炎模型细胞中TLR4、IRF3、IRF7、IFN-α、IFN-β和CXCL10、TNF-α基因m RNA的上调（P＜0.05）。5.MS19对LPS诱导的牙髓炎的影响:为了验证MS19是否能够抑制LPS诱导的牙髓炎症,我们采用了Elisa法检测了MS19对牙髓炎模型细胞分泌炎症因子IL-6和TNF-α蛋白表达的影响。结果显示:MS19能够降低牙髓炎模型细胞中炎症因子IL-6和TNF-α的表达（P＜0.01）。6.MS19治疗LPS诱导牙髓炎的可能机制:有研究报道,IRF基因家族N末端DNA结合域（DNA binding domain,DBD）的识别序列与MS19具有序列相似性,因此我们猜测MS19能够减轻LPS诱导的牙髓炎,可能是通过干扰IRF7的活性,降低下游细胞因子IFN-α和CXCL10实现的。为了验证IRF7是否能与MS19结合,我们提取LPS感染的hDPSCs总蛋白,与MS19进行pull down实验。结果显示:MS19能与IRF7结合。结论:1、组织块结合酶消化法成功分离培养出hDPSCs。2、成功建立了人牙髓炎的体外模型。3、LPS能够在体外迅速激活感染后可迅速激活hDPSCs中的IRF7-IFN-α信号通路相关基因,说明IRF7在LPS感染过程中发挥一定作用。4、MS19可能通过靶向IRF7来调节IRF7-IFN-α信号通路,抑制下游炎症因子的转录,进而起到治疗炎症的作用。