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原发性肝癌（primary liver cancer,PLC）在中国是常见恶性肿瘤疾病,肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC,以下简称肝癌）约占原发性肝癌总病例数的80%,是最主要的病理类型。肝癌侵袭性强,易于早期转移,目前临床上首选的治疗措施为手术治疗。然而由于肝癌早期症状不明显,多数患者就诊时已多发展至中晚期而丧失手术机会。尽管以化疗、放疗为代表的综合治疗在一定程度上可以缓解症状,但对于患者5年生存率的提高和生活质量的改善收益甚微。所以深入研究肝癌增殖、侵袭等恶性生物学行为及内在机制,寻找新的治疗靶点,提高肝癌治疗效果仍然是本领域现阶段的研究重点。肝癌的发生发展是涉及一系列相关基因转录、蛋白表达、癌基因激活与抑癌基因失活的序贯事件总和。其内在作用机制至今尚未完全研究清楚。DHX9是一种基于NTP的包含有解螺旋酶保守核心结构域的解螺旋酶,其功能包括调控DNA复制、转录与翻译,microRNA合成,RNA加工与运输,保持基因组稳定性等。近年来多项研究发现癌组织内DHX9高表达,并且在癌细胞内作为癌基因发挥作用。例如DHX9在前列腺癌细胞内与SOX4相结合促进前列腺癌细胞发生侵袭;DHX9在乳腺癌细胞内与EGFR相互作用促进乳腺癌细胞发生癌细胞转移。同时也有实验发现DHX9在神经母细胞瘤内作为抑癌基因起作用。目前DHX9在肝癌中的表达,对肝癌细胞恶性生物学行为的影响和作用机制以及与肝癌患者预后的关系尚无系统性研究和文献报道。为明确以上问题,本课题将从以下四个方面展开研究以期阐明DHX9对肝癌细胞恶性生物学行为的调控机制,并为肝癌的临床治疗提供潜在的靶点。第一部分:肝癌组织DHX9蛋白质组学检测及其与患者预后相关性分析。第二部分:DHX9在肝癌中的表达及与临床因素相关性分析。第三部分:DHX9对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭能力调控作用的研究。第四部分:DHX9对肝癌细胞恶性生物学行为作用机制的研究。第一部分肝癌组织DHX9蛋白质组学检测及其与患者预后相关性分析目的应用蛋白质组学技术分析检测肝癌组织和癌旁非肿瘤肝组织中DHX9的表达水平,使用GEPIA在线数据库分析DHX9和肝癌患者预后相关指标的关系。方法1.收集40例（对）肝癌组织和相应的癌旁非肿瘤肝组织手术切除标本。2.组织蛋白提取、纯化、定量后行质谱、蛋白质聚类、蛋白交互作用分析等蛋白质组学实验。3.GEPIA在线分析肝癌组织与非肿瘤肝脏疾病组织DHX9的表达以及与患者预后的相关性。结果1.经统计40例（对）肝癌组织和其对应的癌旁非肿瘤肝组织内共有288种差异蛋白,其表达水平在肝癌组织与癌旁非肿瘤肝组织内呈显著差异。2.40例（对）肝癌组织和其对应的癌旁非肿瘤肝组织内DHX9呈差异化表达,肝癌组织DHX9表达明显高于癌旁非肿瘤肝组织（P＜0.001）。3.PPI显示DHX9在肝癌细胞内可能通过CTNNB1与BCL-2、BAX、MMP2、MMP9、MAPK1、STAT3等蛋白发生作用。4.生物学信息数据库TCGA、GTEx分析显示肝癌组织DHX9基因转录水平（mRNA）明显高于非肿瘤肝组织。5.DHX9高水平表达肝癌患者较DHX9低水平表达肝癌患者总生存期（Overall Survival,OS）时间缩短（P=0.0087）;同时DHX9高水平表达肝癌患者较DHX9低水平表达肝癌患者无疾病生存期（Disease Free Survival,DFS）时间缩短（P=0.034）。结论1.蛋白质组学实验发现肝癌组织DHX9表达水平高于癌旁非肿瘤肝组织。2.TCGA及GTEx数据库分析显示DHX9在肝癌组织转录水平高于非肿瘤肝组织。3.TCGA及GTEx数据库分析显示DHX9表达水平与肝癌患者总生存期、无疾病生存期呈负相关。第二部分DHX9在肝癌中的表达及与临床因素相关性分析目的检测DHX9在肝癌组织与癌旁非肿瘤肝组织、肝癌细胞系与肝细胞系内基因与蛋白的表达水平,统计分析DHX9表达水平与各有关临床因素的相关性,探讨DHX9的临床意义。方法1.收集69例（对）肝癌组织和相应的癌旁非肿瘤肝组织。2.分别采取qRT-PCR技术、Western-blot技术检测肝癌组织和癌旁非肿瘤肝组织内DHX9在核酸（mRNA）和蛋白水平上的表达。3.运用免疫组化（ICH）技术检测肝癌组织和相应的癌旁非肿瘤肝组织内DHX9蛋白的表达量。4.对所收集肝癌组织样本中DHX9表达量与患者年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期、肿瘤数量、血管侵犯、淋巴结转移数量、转移等临床因素进行相关性分析和单因素、多因素分析。5.培养 Huh-7、Hep3B、SMMC-7721、MHCC97H、HepG2、BEL7402 6 种肝癌细胞系和L02正常肝细胞系。6.分别采用qRT-PCR技术、Western-blot技术检测DHX9在以上6种肝癌细胞系和正常肝细胞系L02中核酸（mRNA）和蛋白水平的表达。结果1.qRT-PCR与Western-blot检测结果示肝癌组织中DHX9在核酸（mRNA）和蛋白水平上的表达量明显高于其癌旁非肿瘤肝组织,表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.对所收集的69例（对）肝癌组织和相应的癌旁非肿瘤肝组织进行免疫组化染色和阳性综合评分后,结果提示肝癌组织与癌旁非肿瘤肝组织内DHX9均有表达且主要表达于细胞质,细胞核内几乎没有表达。肝癌组织内DHX9表达明显高于癌旁非肿瘤肝组织（P＜0.05）。此实验结果进一步证实了以上Western-blot检测DHX9在肝癌组织与癌旁非肿瘤肝组织的明显差异表达（P＜0.05）。3.对69例（对）肝癌患者的临床病历资料进行统计分析发现,DHX9表达量与患者性别、年龄、肿瘤数量、肿瘤大小、HBV感染、AFP、分化程度、肝硬化、淋巴结转移、复发等临床因素无关（P＞0.05）;但与TNM分期、血管侵犯、转移三种临床因素有关（P＜0.05）。其中DHX9在肝癌TNM分期（Ⅲ+Ⅵ）表达水平显著高于肝癌TNM分期（Ⅰ+Ⅱ）（P=0.007）;DHX9在已发生血管侵犯的肝癌组织的表达水平明显高于未发生血管侵犯的肝癌组织（P=0.021）;DHX9在已发生转移的肝癌组织表达水平明显高于未发生转移的肝癌组织（P=0.042）。4.根据对69例（对）肝癌组织及相应的癌旁非肿瘤肝组织免疫组化阳性综合评分结果行Kaplan-Meier分析,并以分析结果绘制生存曲线示DHX9高表达水平肝癌患者（n=39）较DHX9低水平表达肝癌患者（n=30）总生存期时间缩短（P=0.030）;DHX9高水平表达肝癌患者较DHX9低水平表达肝癌患者无进展生存期时间缩短（P=0.048）。此结果进一步验证了第一部分TCGA及GTEx等生物学信息数据库分析结果。5.采用log-rank检验对所纳入临床因素进行患者总生存期和无进展生存期进行单因素分析,结果显示肿瘤大小（P= 0.011）、分化程度（P=0.047）、淋巴结转移（P=0.004）、血管侵犯（P=0.001）、转移（P=0.003）、DHX9 表达量（P=0.032）与总生存期有关;肿瘤大小（P=0.024）、血管侵犯（P=0.009）、转移（P=0.001）与无进展生存期有关。就单因素分析结果进一步行多因素Cox分析,结果显示肿瘤大小（P=0.043）、血管侵犯（P=0.038）、DHX9表达量（P=0.045）是总生存期的独立预后因素;肿瘤大小（P=0.001）、血管侵犯（P=0.027）是无进展生存期的独立预后因素。6.qRT-PCR、Western-blot检测结果提示所测6种肝癌细胞系（Huh-7、Hep3B、SMMC-7721、MHCC97H、HepG2、BEL7402）DHX9 核酸（mRNA）与蛋白表达水平均明显高于正常肝细胞系L02（P＜0.05）。结论1.分子生物学实验发现肝癌组织DHX9表达水平明显高于癌旁非肿瘤肝组织,肝癌细胞DHX9表达水平明显高于正常肝细胞。2.DHX9表达水平与肝癌患者TNM分期、血管侵犯、转移等临床因素有关;DHX9表达水平与肝癌患者总生存期、无进展生存期呈负相关。3.单因素及多因素分析显示肿瘤大小、血管侵犯、DHX9表达量是肝癌患者预后的独立因素。第三部分DHX9对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭能力调控作用的研究目的采用一系列体外细胞实验方法检测DHX9对肝癌细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响,探讨DHX9对恶性生物学行为的调控作用。方法1.采用本研究第二部分实验在核酸（mRNA）和蛋白水平DHX9表达最高的MHCC97H肝癌细胞系作为本部分体外细胞实验的研究对象。2.采用siRNA瞬间转染技术敲低肝癌细胞DHX9的表达,转染结束72h后即用Western-blot技术检测转染效果,获得成功敲低DHX9表达的肝癌细胞,之后设立空白对照组（CON,肝癌细胞）、非特异对照组（NC,仅加GP-transfect-Mate转染试剂未进行敲低DHX9的肝癌细胞）和实验组（siRNA,成功敲低DHX9表达的肝癌细胞）进行下列体外细胞实验。3.CCK-8细胞增殖实验检测DHX9对肝癌细胞增殖能力的影响,同时依据检测结果绘制细胞生长曲线。4.划痕实验（Wound Healing test）检测DHX9对肝癌细胞迁移能力的影响作用。5.Transwell细胞侵袭迁移实验检测DHX9对肝癌细胞侵袭和转移能力的影响作用。结果1.相较于空白对照组与非特异对照组,Western-blot实验结果显示实验组（不同浓度转染复合试剂敲低DHX9表达的肝癌细胞）DHX9表达明显降低,其中转染复合试浓度125nM较75nM与100nM的DHX9敲低作用更为明显,DHX9表达显著下调。将125nM作为本部分实验组肝癌细胞转染复合试剂转染的浓度。2.敲低DHX9表达可以抑制肝癌细胞的增殖。根据CCK-8细胞增殖实验测得OD值绘制细胞生长曲线所示,相较于空白对照组和非特异对照组,实验组肝癌细胞增殖速度明显变缓。其中36h至48h之间增殖抑制作用最为明显（P＜0.01）,48h至96h增殖抑制作用有所变缓（P＜0.01）。3.敲低DHX9表达可以抑制肝癌细胞迁移。根据划痕实验所测空白面积,较空白对照组和非特异对照组,实验组肝癌细胞迁移速度明显变慢,其中48h（P＜0.01）较24h（P＜0.05）时迁移能力抑制强度更为显著。4.敲低DHX9表达可以抑制肝癌细胞侵袭和迁移能力。根据Transwell细胞侵袭迁移实验结果,相较于空白对照组和非特异对照组,实验组肝癌细胞能够穿过聚碳酸酯膜和基质胶的细胞数量显著降低（P＜0.05）。结论DHX9可以促进肝癌细胞体外增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为能力。第四部分DHX9对肝癌细胞恶性生物学行为作用机制的研究目的通过分子生物学方法检测DHX9对肝癌细胞凋亡、EMT及相关信号通路的影响,探究DHX9促进肝癌细胞增殖、迁移及侵袭恶性生物学行为的作用机制。方法1.采用第二部分实验中DHX9 mRNA和蛋白表达水平最高的MHCC97H肝癌细胞系作为本部分实验的研究对象。设立空白对照组（CON,肝癌细胞）、非特异对照组（NC,仅加GP-transfect-Mate转染试剂未进行敲低DHX9的肝癌细胞）、实验组（siRNA,成功敲低DHX9表达的肝癌细胞）进行本部分实验。2.通过流式细胞仪和Annexin V凋亡试剂盒检测敲低DHX9表达后对肝癌细胞凋亡的影响作用。3.Western-blot技术检测敲低DHX9表达后对肝癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响作用。4.Western-blot技术检测敲低DHX9表达后对肝癌细胞EMT相关蛋白表达的影响作用。5.Western-blot技术检测敲低DHX9表达对肝癌细胞内JAK/STAT3、PI3K/AKT、MAPK/ERK、NF-κB4条信号通路关键蛋白表达及磷酸化水平的影响。结果1.敲低肝癌细胞DHX9表达能够促进凋亡。流式细胞仪检测各组肝癌细胞凋亡率,结果显示较空白对照组和非特异对照组,实验组肝癌细胞凋亡率显著升高,其差异具有统计学意义（P＜0.01）。Western-blot检测结果示相较于空白对照组和非特异性对照组,实验组肝癌细胞促凋亡蛋白Caspase3、Bax表达水平显著升高（P＜0.05）,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平显著降低（P＜0.05）。2.敲低肝癌细胞DHX9表达可以抑制EMT发生。Western-blot检测结果显示与空白对照组和非特异性对照组相比,实验组肝癌细胞的上皮表型特异蛋白E-cadherin表达量升高,间质表型特异蛋白MMP2、MMP9、Vimentin表达量降低（P＜0.05）。3.敲低DHX9表达可以升高p-ERK的表达。Western-blot检测结果示JAK/STAT3、PI3K/AKT、NF-κB 3条信号通路关键蛋白及其磷酸化形式蛋白表达水平各组变化不具有统计学意义（P＞0.05）;与空白对照组和非特异性对照组相比,实验组p-ERK表达水平升高明显（P＜0.05）。结论1.分子生物学实验发现DHX9可以通过抑制凋亡促进肝癌细胞增殖。2.分子生物学实验发现DHX9可以促进肝癌细胞EMT,增强肝癌细胞侵袭迁移能力。3.DHX9可能通过MAPK/ERK信号通路的作用调控肝癌细胞的增殖与凋亡,迁移与侵袭等相关恶性生物学行为。