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载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白(apolipoprotein BmRNA editing enzyme,catalytic polypeptide,APOBEC)是一种机体固有免疫抗病毒因子,其主要的生物学功能除涉及脂类代谢、抗体多样化外,最重要的是对许多内源性及外源性反转录病毒、反转座子和一些DNA病毒具有抑制作用。APOBEC分子已被证实能够有效阻抑HIV-1、HBV、MLV及PERV等病毒的复制,其对病毒的抑制主要依赖其胞苷脱氨酶机制,即通过被包装进入病毒粒子并于靶细胞内释放,于病毒反转录过程中催化病毒cDNA第一链胞嘧啶发生脱氨基作用,使病毒cDNA负链发生广泛的dC→dU超突变(正链为G→A),导致病毒无法正常复制或无法组装。APOBEC分子作为参与机体固有免疫因子的重要一员,其新颖的抗病毒机制已逐渐成为研究热点。
将猪细胞、组织及器官应用于猪→人异种移植被认为是解决人类器官移植捐献短缺问题的重要途径之一。然而,猪体内天然含有的猪内源性反转录病毒(Porcine endogenous retrovirus,PERV)成为猪→人异种移植的主要障碍,它被证实能够感染人源细胞并可能导致受体罹患免疫缺陷性疾病。鉴于PERV感染异种移植受体后存在潜在风险,许多降低或消除该风险的策略被陆续提出与尝试,但效果都不够理想且代价较高。猪体内天然含有一种APOBEC分子即猪APOBEC3F,已被证实对HIV-1、MLV等病毒亦存在抑制作用,而其是否能抑制PERV复制尚无定论。若能实现以猪自身免疫机制清除PERV或将其滴度控制在极低的范围这一目标,那么PERV在异种器官移植中的潜在风险就能够得到有效控制。为此,本研究对猪APOBEC3F是否能够抑制PERV的复制及其可能机制进行了探讨,主要工作包括一下几个方面:
首先,利用反转录病毒载体构建了携带猪APOBEC3F基因的重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP,并将该重组质粒与pVSV-G、pGag-Pol共转染包装细胞HEK293T包装出假型病毒,然后用该病毒感染PK15细胞;成功感染后经G418加压筛选,最终获得稳定表达猪APOBEC3F的PK15细胞株,通过PCR、Western blot能够在该细胞内检测到猪APOBEC3F基因的整合和蛋白的表达,为进一步研究猪APOBEC3F对PERV的抑制作用建立了研究模型。
其次,采用相对荧光定量PCR对稳定表达猪APOBEC3F的PK15细胞中的PERV mRNA进行了检测,结果发现PERV mRNA拷贝数仅为正常水平的31%;另一方面,设计靶向沉默猪APOBEC3F的siRNA载体并实现对该基因的沉默,通过荧光定量PCR分析发现PERV在猪APOBEC3F沉默的情况下拷贝数为对照的6倍左右,实验结果表明,猪APOBEC3F对PERV存在抑制。
最后,通过酵母双杂交实验验证了猪APOBEC3F与PERV-Gag存在相互作用,而Western blot检测证实了PERV对猪APOBEC3F实现了包装;与此同时,分析稳定表达猪APOBEC3F的PK15细胞的PERV基因组序列发现,PERV在猪APOBEC3F持续表达条件下发生了G→A的突变,以上结果提示猪APOBEC3F很可能由PERV-Gag引导被包装入病毒粒子,最终通过胞苷脱氨作用对PERV产生抑制。
综上所述,本研究证实了猪APOBEC3F具有抗PERV复制作用,而PERV基因组的G→A突变提示了猪APOBEC3F很可能通过胞苷脱氨机制实现对PERV的抑制。本研究为进一步深入研究猪APOBEC3F抑制PERV机制奠定了基础,同时也为探讨可能存在的PERV拮抗猪APOBEC3F作用开辟了思路。