牛乳铁蛋白肽是牛乳铁蛋白在酸性环境下经胃蛋白酶水解,从N端释放出的具有多种生物学活性的短肽,具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫、免疫调节等多种功能。牛乳铁蛋白肽应用于食品中,安全无毒副作用、没有残留的隐患、更不会对环境造成潜在威胁,被广泛用作食品防腐剂、营养添加剂等。由于牛乳铁蛋白肽广谱的抑菌活性,以及其对抗生素耐药菌株的杀伤作用,使其在新型抗菌肽类药物领域具有广阔的发展前景。但是牛乳铁蛋白肽的来源受限,生产成本高,近年来借助外源基因表达系统可以显著降低牛乳铁蛋白肽的生产成本,为其应用于生产实践提供了基础。乳酸乳球菌作为食品级微生物,既有天然的益生作用,同时并不会受到牛乳铁蛋白肽的抑制作用,是理想的表达牛乳铁蛋白肽的宿主菌,因此本研究利用乳酸乳球菌表达的牛乳铁蛋白肽,明确其抑菌活性及抑菌机制,为重组菌表达牛乳铁蛋白肽作为微生态制剂应用于生产提供理论依据。本研究基于实验室已成功构建的表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌p AMJ399-LFcin BA/MG1363展开实验。首先制备抗牛乳铁蛋白肽LFampin的单克隆抗体,将牛乳铁蛋白作为免疫原,对SPF级的BALB/c小鼠进行腹腔免疫,采用细胞融合技术将完成免疫程序的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行体外细胞融合,利用牛乳铁蛋白肽LFampin对融合后的细胞进行筛选克隆,最终制备了3株可以稳定分泌抗牛乳铁蛋白肽LFampin单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别将其命名为:2C5、2C6、3E2。并对其稳定性、特异性、亚类等生物学特性进行分析,证明筛选出的三株杂交瘤细胞能稳定的分泌单克隆抗体,可以与LFampin特异性的结合,确定2C5和2C6抗体亚类为Ig G1,3E2为Ig M,将单克隆抗体2C6及实验室保存的抗LFcin单克隆抗体4E10进行纯化,分别用TRITC、FITC将纯化后的单克隆抗体进行标记。利用单克隆抗体2C6和4E10对表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌进行鉴定,确定重组菌p AMJ399-LFcin BA/MG1363的上清中表达牛乳铁蛋白肽的浓度为24.39μg/m L,菌体中表达牛乳铁蛋白肽的含量为33.51μg/mg。探究重组菌表达牛乳铁蛋白肽的体外细胞毒性作用,利用CCK-8检测其对RAW 264.7细胞的毒性作用,并对小鼠红细胞溶血率进行测定。结果表明重组菌表达的牛乳铁蛋白肽对小鼠红细胞及RAW 264.7细胞没有明显的细胞毒性作用。为了探究重组菌表达牛乳铁蛋白肽的抑菌活性,利用牛津杯法检测重组菌上清对35株细菌的抑菌圈直径大小,利用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度。结果表明重组菌表达的牛乳铁蛋白肽对25株病原菌均有不同程度的抑制作用,最小抑菌浓度范围在16-128μg/m L,对10株益生菌及粪肠球菌没有明显的抑制效果,证明重组菌表达的牛乳铁蛋白肽具有广谱的抑菌活性,但对特定的益生菌没有抑制作用。为了探究表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌的抑菌机制,利用扫描电镜、透射电镜、荧光显微镜观察重组菌表达的牛乳铁蛋白肽对菌体结构的影响,利用凝胶阻滞实验探究其对细菌基因组DNA的影响,利用粘附实验探究其对大肠杆菌、鸡白痢沙门菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌粘附Caco-2和IPEC细胞的影响,结果表明重组菌表达的牛乳铁蛋白肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、鸡白痢沙门菌菌体的完整性具有不同程度的破坏作用,其主要作用靶点为细菌的细胞膜;凝胶阻滞实验结果表明重组菌表达的牛乳铁蛋白肽可以抑制细菌DNA的迁移,证明其可能与细菌DNA结合,从而抑制细菌生长;粘附实验结果表明重组菌表达的牛乳铁蛋白肽可以有效减少细菌对细胞的粘附作用。以上实验结果表明,重组乳酸乳球菌表达的牛乳铁蛋白肽具有广谱的抑菌活性,对真核细胞没有明显的细胞毒性作用,可以安全的应用于机体,同时作用于多个靶点发挥抑菌活性,降低了单一靶点易产生耐药性的风险,为重组菌表达牛乳铁蛋白肽作为微生态制剂提供理论依据。